一种葡聚糖微球凝胶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水凝胶微球的制备方法，具体涉及一种特定孔径交联葡聚糖微球 凝胶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 微柱凝胶技术是1986年由法国人Dr.YvesLappierre发明的可用于血型血清学 检测的检验技术，1994年获得美国FDA认证，目前在许多发达国家已经作为常规技术应用 于临床。属于尺寸排除色谱法（sizeexclusionchromatography)，其主要原理是利用不同 生物大分子具有不同的流体动力学体积，通过具有一定孔径的凝胶（凝胶空隙）来达到分 离的目的。以使用微柱凝胶法测定血型为例，在微柱管中，注入微球凝胶作为填充物，微球 与微球之间的缝隙形成特定均一的孔径，形成凝胶分子筛，待检红细胞与相应的抗体在凝 胶上层结合，经低速离心后，凝集的红细胞块由于体积大，无法通过凝胶分子筛而被阻隔于 凝胶中，呈阳性反应，而未与抗体结合的单个游离红细胞则可以通过凝胶分子筛沉积到管 底，呈阴性反应，由此判断待检血液的血型。
[0003] 微柱凝胶法的最大优点就是结果客观，它规定了统一的离心力和离心时间，操作 可标准化，红细胞在凝胶中稳定存在，不会产生漂移现象，重复性好，几乎没有人为干扰，方 法简单易行。检测后标本（血型卡）图像及实物可以较长时间保存，便于复查。另外，由于 所需样本量少，该法特别适合于样本不易抽取的患者（如大面积烧伤者及婴幼儿等）。目 前，微柱凝胶技术在欧美等发达国家输血领域已作为常规技术引入到血型定型中。由于正 常人红细胞直径为7. 0-7. 6ym，平均为7. 33ym，被相应的抗体结合后，会形成太小不一的 凝集块，必须精确控制微柱凝胶间隙在14-20ym之间，以保证筛分出单个红细胞与凝集红 细胞块，间隙的大小由微球的粒径大小及均匀度决定，故精确控制微球凝胶的粒径大小及 粒径分布范围是微柱凝胶检测技术核心所在。
[0004] 国内至今仍缺乏对微珠凝胶的合成工艺研究，目前临床应用中主要依赖进口，进 口的不同型号微珠凝胶干胶价格高达2. 5-3. 5万元/公斤，以微珠凝胶与保存液按7 :3比 例配制成的湿胶，高达2000-3000元/升，货期一般长达6-8周，成本高、货期长等因素严重 制约着微柱凝胶技术在国内的普及应用，导致微柱凝胶技术在国内的普及程序低。
[0005] 除直接应用进口微柱凝胶外，目前可检索到的凝胶合成技术（杨振平，韩杰，荣瑶 君，交联葡聚糖凝胶微珠的制备I.微珠表面形态的影响因素与控制）主要是：在标准六 叶涡轮搅拌釜中，以甲苯等有机溶剂作为连续相，聚乙酸乙烯酯（PVAc)为分散剂，葡聚糖 的水溶液为分散相，环氧氯丙烷（ECH)为交联剂，通过反相悬浮聚合的方式得到交联葡聚 糖的微球凝胶。以标准六叶涡轮搅拌釜仪器结构复杂，难以标准化控制反应条件，不利于工 业化生产；此外，甲苯等有机溶剂大多具是有毒性，会对操作员工和自然环境造成重大的污 染，在目前提倡职业健康及环境保护的大趋势下不可以大量使用。
[0006] 由于甲苯的粘度低，容易造成预分散好的葡聚糖小液滴不同程度的团聚，难以控 制微球的粒径大小及分布范围，所制得的微球直径分布在5-300ym之间，而各种应用领域 对粒径的要求不一致，粒径分布范围过广导致各种领域应用效果均欠佳。这种方法制得的 微球凝胶粒径大小分布范围在5-300ym之间，大小不一，分布不均，不能很好的满足应用 需求。
[0007] 此外，其交联反应的原理为：葡聚糖在碱性条件下，以环氧氯丙烷为交联剂可以得 到交联葡聚糖，反应方程式为：
dextran
[0009] 从交联反应机理中可以看出，碱是可以中和交联过程中生成的盐酸，从而使交联 反应顺利的进行。当碱性不够强，就会使的交联不完全，从而得到的微球容易造成粘连和机 械强度不够，导致微球碎片产生，影响使用效果。而在碱性条件下PVAc会水解成PVA，水解 反应方程式为：
[0010]
[0011] 根据水解程度的不同，会使-Ac基的残余量不同。当PVAc的水解程度过大时，生 成的PVA是水溶性的，就使其失去了作为分散相保护膜的作用，容易造成葡聚糖小液滴发 生团聚。因此，在碱性条件下，聚乙酸乙烯酯（PVAc)的分解和葡聚糖的交联反应是个竞争 反应。必须要找到一个合适的碱性点，要既利于葡聚糖的交联，又不能使PVAc发生过度的 水解，此过程要考虑的影响因素太多，工艺难控制，不利于工业化生产。
【发明内容】
[0012] 针对上述问题，本发明提出一种以国产原料为基础，合成价格低廉，工艺可控，安 全环保，且粒径大小分布范围窄，机械强度高的交联葡聚糖微珠凝胶的制备方法。
[0013] -种葡聚糖微球凝胶的制备方法，其步骤如下：分别配制分散相葡聚糖溶液和连 续相溶液；将分散相溶液匀速滴加至连续相溶液中，同时利用均质乳化设备使混合物充分 乳化；加入交联剂，机械搅拌使混合物充分交联，制得葡聚糖微球凝胶。
[0014] 进一步地，所述分散相葡聚糖溶液为葡聚糖的氢氧化钠溶液；所述连续相为加入 乳化剂的油；所述交联剂为N，N' -亚甲基双丙烯酰胺。
[0015] 进一步地，所述氢氧化钠溶液为2. 5M氢氧化钠溶液。
[0016] 进一步地，所述油为蓖麻油、矿物油、橄榄油或大豆油。
[0017] 进一步地，所述的方法具体包括以下步骤：
[0018] 1)配制分散相：称取葡聚糖3. 0~6. 0±0. 3g，加入至2. 5M氢氧化钠溶液里，置均 质乳化设备下搅拌，搅拌参数为600±lOOrpm，至葡聚糖完全溶解成无色透明溶液，作为分 散相，备用；
[0019] 2)配制连续相：称取司盘802. 5±0. 3g，加入至60±5g油中，置均质乳化设备下搅 拌，搅拌参数为600 ±100rpm，至司盘80完全溶解至油内；
[0020] 3)在相同的搅拌速度下，把上述步骤1)制得的分散相滴加至上述步骤2)制得的 连续相内，以蠕动栗控制滴加速度为5. 0±0. 5ml/h;
[0021] 4)分散乳化反应：控制温度在25±5°C滴加，滴加完成后，保持温度在25±5°C，调 节均质乳化设备参数为600~1200±100rpm，25-30min，以充分分散乳化；
[0022] 5)交联反应：分散乳化完成后，加入交联剂，控制室内温度在25±5°C，切换机械 搅拌设备，参数为600±50rpm，14±lh，以充分交联。
[0023] 进一步地，所述步骤5)中，交联剂为N，N' -亚甲基双丙烯酰胺，质量为2. 5±0. 3g。
[0024] 进一步地，所述步骤2)中，所述油为蓖麻油、矿物油、橄榄油或大豆油。
[0025] 进一步地，所述步骤4)和5)中，控制反应温度在20~30°C
[0026] 进一步地，所述的方法还包括以下步骤：
[0027] 6)静置：交联反应完成后，静置0. 5±0.lh，吸弃上清液，收集微球凝胶。
[0028] 7)洗涤：以30%乙醇溶液洗涤上述微球凝胶4-5次后，按3 :7的比例将乙醇溶液 与微球凝胶混合保存，得到所述葡聚糖微球凝胶。
[0029] 8)干燥：置真空冷冻干燥机内，干燥24 ±lh形成干粉，收集微球凝胶干粉，得到葡 聚糖微球凝胶干粉。
[0030] 本发明的内容还包括上述制备方法得到的葡聚糖微球凝胶。
[0031] 相对于现有技术，本发明具有以下优点：
[0032] 1)采用国产原料为基础，原料易得且成本低，供应周期短，可大幅降低微珠凝胶的 价格。
[0033] 2)采用均质乳化设备作为分散的设备，可控范围大（100-23000rpm)，精确