一株植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株新菌种及其应用，具体涉及一株植物乳杆菌GLM101的分离鉴定， 及其在抑菌剂及饲料添加剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 在养殖技术领域中，抗生素的使用能够有效地预防动物疾病，降低动物死亡率，减 少肉品污染的风险。但是，其在动物饲料中的滥用造成动物性食品抗生素残留超标，使动物 和人体存在对抗生素产生耐药性的风险。欧盟自2006年起将全面禁止食品动物食用抗生 素促生长饲料添加剂，而且，抗生素对动物和人类的健康造成的风险也已引起我国农业部 门的重视。加强管理养殖环节抗生素的合理使用和畜禽食品中抗生素残留超标，成为食品 安全领域关注的热点。
[0003] 益生菌是动物肠道内的正常菌群，对动物体没有毒副作用。其附着在动物肠道内， 一方面产生一些抑制病原菌生长的物质，另外在生长代谢过程中，可以分泌多种酶类，促进 动物对饲料的消化吸收，提高料肉比，促进动物健康生长。因此益生菌制剂成为国内外业界 研究的热点。
[0004] 植物乳酸杆菌属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，最适生长温度为30~37°C，兼性 厌氧，最适PH6. 5左右。植物乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许 多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物有 重要影响，无论在食品发酵，还是在工业乳酸发酵以及饲料添加剂等领域，都有着广泛的应 用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株植物乳杆菌LactobacillusplantarumGLM101。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述植物乳杆菌在制备饲料添加剂中的应用。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
[0008] 申请人将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏中心于2015年7 月23日收到申请人提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CGMCCNo. 11156,建议 的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，已于2015年7月23日鉴定保藏的菌 株是存活的。
[0009] 本发明的有益效果是：
[0010] 本发明提供了一株植物乳杆菌GLM101，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门 氏菌、创伤弧菌和嗜水气单胞菌具有显著的抑制作用；具有较好的耐酸性，可在pH2.0的 条件下生存；具有耐胆盐能力，在1~3%。胆盐条件下能够生长。
[0011] 本发明的提供的一株植物乳杆菌可用于制备饲料添加剂，并适合应于畜禽、水产 养殖的全过程。菌株GLM101能够有效的提高保育猪的生产性能，也能明显提高猪群的健康 水平，减少抗生素及其他药物的使用，节省成本。
[0012] 本发明植物乳杆菌可用于调节动物肠内微生态平衡，具有增强非特异性免疫功能 来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提 高饲料转化率。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0014] 实施例1植物乳杆菌GLM101的分离、筛选、鉴定及保存
[0015] 1. 1菌株的分离
[0016] 取健康仔猪粪便样品，用无菌水分别进行10、100、1000倍稀释，取200iiL涂布于 MRS固体培养基，37°C培养48小时，挑取菌落，划线MRS培养基，经4次纯化后，挑取单菌落 至MRS肉汤中培养至对数期，加入终浓度20%甘油，-80°C下保存备用。经革兰氏染色、触 酶试验、硝酸盐还原试验和16SrDNA测序。
[0017] 1.2菌株形态学特征鉴定
[0018] 取纯化菌株（命名为GLM101)的单菌落，转接到MRS固体培养基（琼脂）上，于 37°C恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、 粘性、透明度等特点。结果显示，菌株GLM101在MRS固体培养基上形成边缘整齐，光滑，粘 稠，表面光泽，不透明的菌落。在显微镜下观察，为杆状。
[0019] 1.3菌株的生理生化特征
[0020] 挑取菌株GLM101在MRS固体培养基（琼脂）上培养24h的新鲜培养物，进行生理 生化测试。结果显示，GLM101为革兰氏阳性杆菌。
[0021] 1. 3. 1API20NE鉴定特征
[0022] 利用法国梅里埃API20NE标准鉴定系统测定菌株GLM101利用碳源及产酸情况， API20NE试验条是由20个含干燥底物或培养基的小管所组成。
[0023] 1)API20NEAUX培养基成分：(NH4)2S042g，琼脂1. 5g，无机盐基础82. 8mg，氨基酸 250mg，维生素和营养物底物35. 9mg，磷酸缓冲液0? 04M加至1000ml，最终pH为7. 0~7. 2 ;
[0024] 恥(：10.85%培养基：恥(：18.58，11201000111匕
[0025] 2)在平板上培养菌株，以接种针从分离物的平板上挑取1~4份纯单个菌落至 2ml含0. 85%NaCl的培养基中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，所需浓度为0. 5麦氏单 位标准浊度。打开AUX培养基的安瓿管加入200yL(6~8滴）剩下的生理盐水菌悬液至 安瓿，仔细混匀，但要避免有气泡产生。
[0026] 3)盐水菌悬液和接种的AUX培养基分别加入相应的试验条小管，迎，麵和CIRE 则用矿物油覆盖。
[0027] 4)盖上培养盒，于30°C培养24小时后观察现象，结果如表1所示。
[0028] 表1?菌株GLM101生化鉴定结果
[0029]
[0030] 注：+ :表示反应为阳性；_ :表示反应为阴性；
[0031] 从表1中可以看出，本发明菌株可以葡萄糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、硝酸钾、七叶 灵、对硝基-D-甲基半乳糖为碳源。
[0032] 1. 3. 2APIZYM鉴定特征
[0033] 利用法国梅里埃APIZYM系统，可系统和快速地研究菌株GLM101产酶能力，API ZYM试验条是由20个小管所组成，它的底部是一个专门设计含有酶底物和缓冲液的支持 物。步骤如下：
[0034] 1)用2ml无菌蒸馏水挑新鲜细菌培养物制备一个菌悬液，其混浊度在McFarland No5和No6之间。
[0035] 2)用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本（65微升）。
[0036] 3)接种后，于37°C培养箱培养4小时。
[0037] 4)培养后，加1滴ZYMA试剂和1滴ZYMB试剂。观察颜色并记录结果如表2所 示：
[0038] 表2?菌株GLM101生化鉴定结果
[0039] CN105132322A 说明书 4/11 页
[0040] 注：+ :表示反应为阳性；_ :表示反应为阴性;w:表示反应较弱。
[0041] 从表2中可以看出，本发明菌株GLM101具有产白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、 0 _半乳糖甙酶、a-葡萄糖甙酶、0 -葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶等功能。
[0042] 1. 4菌株的分子生物学鉴定
[0043] 1)利用天跟细菌基因组提取试剂盒（TIANAMPBacteriaDNAKit)提取菌株 GLM101的基因组DNA，步骤按厂家说明书要求所述。利用细菌通用引物27F，1492R扩增菌 株16SrDNA片段。
[0044] 2)如上所述的引物对序列为，1492R:TACCTTGTTACGACTT，27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。
[0045] 3)菌株的16SrRNA基因测序的结果如SEQIDN0. 1。在NCBI上比对后发现其与 模式菌株Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC14917 (T)的相似性达到为 99. 93%，综合菌株GLM101有关生理生化指标和分子生物学鉴定结果，结合其形态学特征， 我们将其命名为LactobacillusplantarumGLM101，于2015年年7月23日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCN0. 11156。
[0046] 1. 5菌株的功能筛选
[0047] 1.5.1耐酸性试验。
[0048] 实验选取前期从健康仔猪肠道、植物、奶酪、市售同类产品等来源分离纯化到乳酸 菌菌株作为对照，经革兰氏染色、触酶试验、硝酸盐还原试验和16SrDNA测序等鉴定，这些 乳酸菌菌株分别属于奠肠球菌4株、屎肠球菌2株、发酵乳杆菌2株、干酪乳杆菌2株、戊糖 乳杆菌2株、植物乳杆菌5株、罗伊氏乳杆菌3株、鼠李糖乳杆菌3株、唾液乳杆菌2株、嗜 酸乳杆菌1株。16SrDNA测序比对分析结果见下表3。
[0049] 表3.相关分离所得乳酸菌菌株的鉴定结果
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[0052] 实验方法：用HC1调节液体培养基至pH2. 0。将菌种以的5% (V/V)的接种量分 别接种上述各处理，37°C静置培养。在接种初始及接种后120min取上述各处理中培养菌 液，进行平板计数，从而计算出细菌的存活率，以pH6.0的菌液为对照。存活率（％)=待 测pH的菌液活菌数/pH6. 0的菌液活菌数X100%。实验结果见表4。
[0053] 实验结果：
[0054] 表4.GLM101与其它分离菌株耐酸实验对比结果
[0055]
[0056] 由实验结果可知，所分离的菌株在pH 2.0条件下时的存活率分别为1.2%~ 76. 3%，其中菌株GLM101的存活率最高，达到76. 3%。
[0057] 进一步对菌株GLM101进行耐酸性检测，实验方法为：
[0058] 设4个不同pH值处理，分别用HC1调节液体培养基至pH值为1. 5、2. 5、3. 5、4. 5。 将菌种以的5% (V/V)的接种量分别接种上述各处理，37°C静置培养。在接种初始及接种 后30、60、90、120、1501^11取上述各处理中培养菌液，进行平板计数，从而计算出细菌的存 活率，以pH6. 0的菌液为对照。存活率（％ )=待测pH的菌液活菌数/pH6. 0的菌液活菌 数X100%。实验结果见表5。
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