重组牛共有ω-干扰素及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重组牛共有干扰素及其应用，具体涉及牛共有 IFN-co(CoBoIFN-co)的核苷酸序列及其表达蛋白，以及其生物活性，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 牛IFN-co亚族由结构与功能相近的24个成员组成，牛IFN-co基因具有585个核 苷酸，编码195个氨基酸，含有23个氨基酸的信号肽。牛IFN-o具有4个保守的半胱氨酸， 分别位于第1，29,99和139位，可形成两个分子内二硫键（Cys1-Cys99,Cys29-Cysl39)。
[0003]IFN- ?大约在1. 3亿年前从IFN-a中进化而来，其血清学特性和它的主要结构都 和IFN-a不同。在1985年，Capon等用非严格的人cDNA探针，分离出BoIFN-co,其C端比 IFN-a多了 6个氨基酸，和BoIFN-a-样具有强的抗病毒活性。1998年，Rodriguez等在 毕赤酵母上表达了BoIFN-col，发现其具有种间交叉抗病毒活性。2000年，Boue也在毕赤 酵母上表达了BoIFN-col，发现其能抵抗发情期母羊体内黄体酮的溶解。2015年，本实验室 成功克隆并表达了BoIFN-co24,发现其也具有高的抗病毒活性。
[0004] 用Blast方法在牛基因组上发现BoIFN-co有24个亚型，其中14个具有潜在功 能。这些亚型的同源性在80%以上，不同亚型可能是由不同细胞或同一细胞在不同时期分 泌的，但由于缺乏系统的对比研究，其生物学活性是否有差异目前还不清楚。
[0005] 共有牛IFN-co是一种重组的非天然的I干扰素，其氨基酸的产生是通过比较14 个具有潜在功能的牛IFN-co亚型序列后，把出现频率最高的氨基酸分配到各自相应的位 置设计出来的。第一个共有干扰素是美国安进公司合成的人共有IFN-a。研究发现共有 正^€1与正^€[、正^0、正^?的同源性分别为89%，30%和60%，其抗病毒活性比 天然的IFN-a强。黄丽等人通过扫描17种天然猪IFN-a亚型的序列，将各个相应位置 最常出现的氨基酸组合起来，成功设计并合成出了一种猪的共有IFN-a。研究发现共有 IFN-a的抗病毒、抗细胞增殖、促进NK活性、诱导细胞因子产生及诱导基因表达的能力比 天然IFN-a高。本实验室在2013年成功设计、克隆和表达了牛共有IFN-a，研究发现其抗 病毒活性高于天然的牛IFN-a。关于共有IFN-co,不论是人还是其他动物都没有报道过。 目前，牛全基因组测序计划已经完成，因此人工设计并合成牛共有IFN-co具有重要的生产 和应用价值，也为研制新型抗病毒的牛干扰素制剂提供有意义的探索。
【发明内容】
[0006] 本发明涉及重组牛共有干扰素基因，优化其遗传密码子，以提高蛋白表达量， 利用毕赤酵母表达系统表达不含任何修饰序列的人工合成基因（牛共有IFN-co)，并测定 其抗病毒活性。
[0007] 本发明提供了一种重组牛共有干扰素，所述的重组牛共有干扰素的氨基 酸序列为SEQIDNo. 1所示。
[0008] 编码所述的重组牛共有《 -干扰素的核苷酸序列为SEQIDNo. 2所示。
[0009] 本发明还包括含有上述核苷酸序列的重组表达载体以及含有所述重组表达载体 或者含有上述核苷酸序列的宿主细胞。
[0010] 本发明表达盒（重组牛共有干扰素的基因）可以整合到宿主细胞的基因组 上，这时宿主细胞内不含表达载体，但含有目的基因序列。即含有所述重组表达载体或者含 有上述核苷酸序列的宿主细胞均在本发明的保护范围内。
[0011] 本发明中CoBoIFN-co是一种合成的非天然出现的BoIFN-co杂合体，其氨基酸序 列是通过扫描GenBank中已经公布的所有B〇IFN-〇亚型序列，将各个相应位置最常出现 的氨基酸组合设计而成，其所有氨基酸均来自于B〇IFN-c〇家族各亚型基因序列。在设计 CoBoIFN-co基因序列时，在5'端和3'端分别引入Xhol和EcoRI限制性内切酶识别位点，以 便将基因连接至表达载体pPICZaA上。为了使重组蛋白分泌到细胞外，在设计CoBoIFN-? 基因序列时，在5'端酶切位点后添加了pPICZaA载体上构成蛋白酶（Kex2)酶切位点的碱 基序列AAAAGA。
[0012] 进一步的，本发明提供了一种制备所述的重组牛共有干扰素的方法，其特征 在于，人工合成重组牛共有co-干扰素的基因，将重组牛共有co-干扰素的基因克隆至表达 载体，然后将得到的重组表达载体转化宿主菌，进行重组牛共有《-干扰素的诱导表达，收 集纯化即得。
[0013] 在本发明中，优选的，所述的基因的5'端加入了Xhol限制性内切酶识别位点，且 在其后引入碱基序列AAAAGA构成Kex2蛋白酶的酶切位点，在3'端加入了EcoRI限制性内 切酶识别位点。
[0014] 在本发明中，优选的，包括以下步骤：
[0015] (1)人工合成重组牛共有干扰素的基因；
[0016] (2)将合成的重组牛共有干扰素的基因克隆至酵母表达载体pPICZaA中，得 到重组表达载体pPICZaA-CoBoIFN-co，电转化GS115感受态细胞，用含博来霉素浓度为 200yg/mL的YPD平板筛选阳性克隆，PCR鉴定，得到重组酵母G-P-CoBoIFN- ? ;
[0017] (3)将重组酵母G-P-C〇B〇IFN- ?接种于BMGY培养基中经甲醇诱导表达重组牛共 有《 _干扰素；
[0018] (4)收集菌液上清，用饱和硫酸铵法粗纯重组牛共有干扰素，PBS透析后经 Bradford法定量分泌型〇-干扰素的浓度。
[0019] 在本发明中，优选的，所述的甲醇诱导表达的条件为：每隔24h向培养液中添加 100%甲醇至甲醇浓度为1. 0%，S卩加入量为每毫升培养液中加10微升甲醇，进行诱导表 达，30°C220r/min震荡培养48~96h，离心收集上清液，制备重组牛共有干扰素。
[0020] 更进一步的，本发明还提供了重组牛共有干扰素在制备治疗或预防牛病毒病 的药物中的应用。优选的，引起所述的牛病毒病的病毒为水泡性口炎病毒。
[0021]CoBoIFN-co在毕赤酵母中实现了高效可溶性分泌表达，表达量为0.2mg/mL， 并通过细胞病变抑制法测得CoBoIFN-co在MDBK和PK-15细胞上的抗病毒活性分别为 1.3X107U/mg、4.lX106U/mg，CoBoIFN-o在MDBK和PK-15细胞上具有更强的抑制VSV 病变形成的能力，分别比8〇正~-?24高3.93和12.8倍。本发明证实0^ 〇正1^?的抗 病毒活性显著高于其他同类，更适于临床应用与工业化开发，并且通过遗传密码子优化使 CoBoIFN-w得到了尚效表达。
【附图说明】
[0022] 图1为共有牛IFN-co与14个具有潜在功能的牛IFN-co亚型的比对图；
[0023] 图2为密码子利用率的百分数优化结果图；
[0024] 图3为pPICZaA-CoBoIFN-co重组质粒的酶切鉴定图；其中M为DNA分子质量标 准，1为EcoRI单酶切，2为EcoRI和XhoI双酶切，3为重组质粒；
[0025] 图4为重组毕赤酵母的PCR鉴定结果图，A为CoBoIFN-coS和3'A0X1鉴定图，M 为DNA分子质量标准，1、11为阴性对照，2~10、12~20依次为1~18株酵母菌株；B为 CoBoIFN- ?A和CoBoIFN- ?S鉴定图，M为DNA分子质量标准，1为阴性对照，2为阳性对照， 3~20依次为1~18株酵母菌株；
[0026] 图5为10株重组酵母表达量的比较图；其中1为空载体GS115_pPICZaA诱导后； 2为1号菌株；3为2号菌株；4为3号菌株；5为4号菌株；6为5号菌株；7为6号菌株；8 为7号菌株；9为8号菌株；10为9号菌株；11为10号菌株；
[0027] 图6为10株重组酵母表达蛋白间接ELISA检测图；
[0028] 图7为SDS-PAGE分析酵母分泌蛋白各时间点的表达量图；其中M为蛋白质分子质 量标准；1为24h后分泌蛋白；2为48h后分泌蛋白；3为72h后分泌蛋白；4为96h后分泌 蛋白；
[0029] 图8为SDS-PAGE分析表达量最高的酵母分泌蛋白的表达结果图；其中，M 为蛋白质分子质量标准；1为空载体pPICZaA诱导后；2为诱导96h后分泌的蛋白 pPICZaA-CoBoIFN-co；
[0030] 图9为表达量最高的酵母分泌蛋白的Westernblot分析图；其中，M为蛋白质分 子质量标准；1为空载体阴性对照；2为酵母表达的分泌蛋白pPICZaA-CoBoIFN-co;
[0031] 图10为兔抗BoIFN-?24免疫多抗血清阻断CoBoIFN-co抗病毒活性线图；
[0032] 图11为兔抗BoIFNRl和BoIFNR2免疫多抗血清阻断CoBoIFN-co抗病毒活性曲线 图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0034] 试验材料：
[0035] 1质粒、宿主菌、病毒
[0036] 宿主菌E.coilTGl购自天根公司，酵母分泌表达载体pPICZaA和表达宿主菌 PichiapastorisGS115 均购自Invitrogen公司，水泡性口炎