经由去糖基化步骤对蛋白质的改良纯化的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用去糖基化步骤纯化目的多肽的方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质纯化方案通常包括一个或多个色谱步骤。色谱中的程序的一个实例是使含 有蛋白质的溶液流过装填有各种材料的柱。不同的蛋白质与柱材料不同地相互作用，并且 因此可以由通过柱所需要的时间或从柱上洗脱蛋白质所需要的条件来分离。
[0003] 色谱是用于分离混合物的一组实验室技术的集合术语。使混合物溶解于被称为流 动相的流体中，所述流动相携带混合物通过容纳被称为固定相的另一种材料的结构。混合 物的各种组分以不同的速度行进，引起它们分离。分离是基于流动相与固定相之间的差分 分配（differentialpartitioning)。化合物的分配系数的细微差别导致在固定相上的差 分滞留并且因此改变分离。
[0004] 存在许多不同的色谱方法。
[0005] 疏水作用色谱（HIC)是基于包含疏水区的配体（例如苄基）。配体的疏水部分吸 引蛋白质上的疏水区，并且蛋白质上的疏水区越大，配体与该特定蛋白质之间的吸引力就 越强。
[0006] 离子交换色谱根据化合物的离子电荷的本质和程度分离化合物。将要使用的柱是 根据电荷的类型和强度来选择。阴离子交换树脂具有正电荷（例如胺）并且被用于保留和 分离负电性的化合物，而阳离子交换树脂具有负电荷（例如羧酸盐基团）并且被用于分离 正电性的分子。
[0007] 如所属领域中已知的，混合模式色谱（MMC)或多元色谱是指利用固定相与分析物 之间超过一种形式的相互作用以便实现其分离的色谱方法。其与常规单一模式色谱的不同 之处在于，MMC中的次要相互作用不能太弱，并且因此其也有助于溶质的保留。
[0008] 作为MMC的实例，配体例如可以是苄胺，其中苄基可被视作疏水部分并且胺可被 视作正电荷部分（即，用于例如阴离子交换）。
[0009] 蛋白质的糖基化是真核生物中常用的翻译后修饰。糖基化可以是N连接型（连接 到Asn上）或0连接型（连接到Ser或Thr上）。糖基化对酶的作用可以影响其许多特性， 例如溶解度、疏水性等，并且相反的作用（所谓的去糖基化）也会影响蛋白质特性。
[0010] 如所属领域中已知的，术语"糖苷酶"（也称作糖苷水解酶）是指催化糖苷键结/ 键的水解的酶，糖苷酶在本文中也被称为去糖基化酶。
[0011] 牛奶凝固酶（例如凝乳酶和胃蛋白酶）使牛奶发生酶促凝固是乳酪制造中最重要 的过程中的一个。酶促牛奶凝固是两阶段工艺：在第一阶段中，蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋 白酶攻击K-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态，和在第二阶段中，牛奶随后凝固并且 形成凝固物。
[0012] 凝乳酶（EC3. 4. 23. 4)和胃蛋白酶（EC3. 4. 23. 1)(哺乳动物胃的牛奶凝固酶） 是属于一大类肽酶的天冬氨酸蛋白酶。
[0013] WOO1/58924A2(UpfrontChromatographyA/S,丹麦）描述使用混合模式配体节胺 对牛奶凝固酶（例如凝乳酶）进行色谱纯化。
[0014]W001/58924A2没有描沭在纯化讨稈中在目的蛋白质吸附/结合到配体h之前，与 目的蛋白质的去糖基化有关的本f显著相关件的仵何内容。
【发明内容】
[0015] 本发明要解决的一个问题是提供一种用于纯化目的多肽的新颖方法，其中能够获 得增加量的目的多肽（分子数）。
[0016] 如本文中所讨论的并且不希望受限于理论，本文中相关的重要技术教导内容涉及 本发明的发明人已经确定，通过对目的糖蛋白进行适当去糖基化，目的糖蛋白可以获得对 包含疏水部分和/或正电性部分的配体的更好/更高结合能力。
[0017]因此，去糖基化步骤是本领域技术人员执行的常规步骤，本领域技术人员知晓许 多不同的糖苷酶并且知晓如何将合适的糖苷酶添加到样品中以便获得目的多肽/蛋白质 的本文相关去糖基化。
[0018] 此外，本领域技术人员知晓许多不同的本文相关配体（参见例如综述文章：Yang 等人，JournalofChromatographyA, 1218(2011)8813-8825) 〇
[0019] 本领域技术人员知晓许多本文中相关的纯化/分离技术，其是基于目的蛋白质被 吸附/结合到配体上，实例是例如柱色谱、膨胀床色谱（EBA)、离子交换色谱等。
[0020] 在工作实例中，在本文中可以看到两种结构不同的酶（来源于米黑根毛霉 (Rhizomucormiehei)的毛霉胃蛋白酶（mucorpepsin)和胳盤凝乳酶）的去糖基化获得了对 苄胺配体（即可被视作包含疏水部分（苄基）和正电性部分（胺）的配体）的显著更好的 结合能力。
[0021] 在工作实例中，在本文中可以看到，对于可被视作仅包含疏水部分的配体（参见 本文中的实施例3)和可被视作仅包含正电性部分的配体（参见本文中的实施例4)，也证实 了上文提到的得到积极提高的结合能力。
[0022] 不希望受限于理论，可能的情况是，与例如配体的疏水部分的更高程度的结合可 以通过因为亲水聚糖的损失而引起对配体的亲和力的增加来解释。
[0023] 不希望受限于理论，可能的情况是，与例如配体的正电性部分的更高程度的结合 可以通过聚糖损失而引起的蛋白质表面上电荷的局部暴露的变化来解释。
[0024] 因此，本发明的第一方面涉及一种用于从包含目的多肽的水性介质中纯化此类目 的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0025] (i):获得由包括糖基化形式的目的多肽的许多组分组成的水性样品；
[0026] (ii):将糖苷酶和/或化学处理（例如用高碘酸盐处理）添加到步骤⑴的样品 中，以便使目的多肽去糖基化以获得水性负载介质；
[0027] (iii):将步骤（ii)的负载介质施加到固相上，以便获得目的多肽到配体上的吸 附，所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配 体；
[0028](iv):从固相上洗脱目的多肽以便回收目的多肽，并且因此获得经过纯化的目的 多肽；
[0029] 其中与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤（ii)的比较方法相比，在步 骤（iv)中获得的经过纯化的目的多肽的量（分子数）增加了至少5%。
[0030] 优选地，在第一方面的步骤（ii)中添加糖苷酶。
[0031] 对于本领域技术人员来说，实施同样执行的比较方法以测试在步骤（iv)中获得 的经过纯化的目的多肽的量（分子数）是否因为在步骤（ii)中添加了糖苷酶而增加了至 少5 %是一项常规工作。
[0032] 本领域技术人员简单地执行第一方面的方法和比较方法，其中除了在比较方法中 没有在步骤（ii)添加糖苷酶之外，其它的一切都完全相同。
[0033] 如果结果是，与同样执行的比较方法（即没有步骤（ii))相比，在步骤（iv)中获 得的经过纯化的目的多肽的量（分子数）增加了至少5%，那么情况便是，与同样执行的用 于纯化目的多肽的不包括步骤（ii)的比较方法相比，在步骤（iv)中获得的经过纯化的目 的多肽的量（分子数）增加了至少5%。
[0034] 优选地，与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤（ii)的比较方法相比，在 步骤（iv)中获得的目的多肽的量（分子数）增加了至少10%。
[0035] 更优选地，与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤（ii)的比较方法相比， 在步骤（iv)中获得的目的多肽的量（分子数）增加了至少25%。
[0036] 甚至更优选地，与同样执行的用于纯化目的多肽的不包括步骤（ii)的比较方法 相比，在步骤（iv)中获得的目的多肽的量（分子数）增加了至少50%。
[0037] 如所属领域中已知的，分子数的合适单位是被称为摩尔的单位。
[0038] 如所属领域技术人员所理解的，包含步骤（iv)的经过纯化的目的多肽的组合物 将具有不同的糖基化特征，即其可被视为新的组合物。
[0039] 因此，本发明的第二方面涉及一种包含经过纯化的目的多肽的组合物，其中所述 组合物可通过如本文中所述的第一方面和其实施方案的方法获得。
[0040] 不希望受限于理论，人们认为，牛奶凝固酶的所有市售相关产品都是通过使用真 核生产宿主细胞生产或者从例如相关的动物胃（例如牛的胃）提取，所述真核生产宿主细 胞或相关的动物胃在生产/表达（例如重组生产）期间使目的牛奶凝固酶糖基化，换句话 说，牛奶凝固酶的所有市售相关产品都是被糖基化的酶。
[0041] 市售相关实例是例如在EP0805866B1 (Harboe等人，Chr.HansenA/S,丹麦）中 描述的来源于米黑根毛霉（Rhizomucormieheias)的毛霉胃蛋白酶，其中市售相关产品 Hannilase?(Chr.HansenA/S)是通过使用米黑根毛霉真核生产宿主细胞来生产。
[0042] 另一个实例是在例如W002/36752A2 (Chr.Hansen)中描述的单峰驼（Camelius dromedarius)凝乳酶，其中市售相关产品CHY-MAX?M(Chr.HansenA/S)是通过使用 黑曲霉（Aspergillusnigeras)真核生产宿主细胞来生产。
[0043] 如以上所讨论并且不希望受限于理论，本文中相关的重要技术教导内容涉及本发 明的发明人已经确定，通过对目的糖蛋白进行适当去糖基化，糖蛋白可以获得对包含疏水 部分和/或正电性部分的配体的更好/更高结合能力。
[0044] 因此，基于本文中的技术教导内容，人们可以说，本领域技术人员可以常规地确定 如本文所述的第一方面的方法的一种替代性方法，用于纯化市售的相关目的牛奶凝固酶， 其中所述方法基本上在使用不导致牛奶凝固酶的显著糖基化的生产宿主细胞时可以见到。
[0045] 这种未被显著糖基化的目的牛奶凝固酶然后可以通过将其施加到如本文所述的 与本发明的第一方面和其实施方案有关的相关配体上来纯化。
[0046] 因此，本发明的另一方面涉及一种用于从包含目的牛奶凝固酶的水性介质中纯化 此类目的牛奶凝固酶的方法，其中所述方法包括以下步骤：
[0047] (I):在生产宿主细胞中生产目的牛奶凝固酶，其中所述生产宿主细胞不导致牛奶 凝固酶的显著糖基化，以获得由包括至少10克（干物重）（例如优选地至少100克或至少 Ikg干物重）基本上未被糖基化形式的目的牛奶凝固酶的许多组分组成的水性样品，并且 因此获得水性负载介质；
[0048](II):将步骤⑴的负载介质施加到固相上，以便获得目的多肽到配体上的吸附， 所述固相包含固体底基质，所述固体底基质含有包含疏水部分和/或正电性部分的配体； 和
[0049] (III):从固相上洗脱目的牛奶凝固酶以便回收目的牛奶凝固酶，并且因此获得经 过纯化的目的牛奶凝固酶。
[0050] 如本领域技术人员在本发明中所理解的，步骤（I)的合适生产宿主细胞的本文相 关实例可以是例如原核生产宿主细胞（例如杆菌属的大肠杆菌）。
[0051] 如所属领域中已知的，一些真核生产宿主细胞也可能是特征在于不导致目的蛋白 质（这里是目的牛奶凝固酶）的显著糖基化的细胞。这种细胞的本文中相关的合适实例是 基因工程细胞，其中糖基化所必需的基因被失活（例如删除或突变）。
[0052] 如本领域技术人员在本发明中所理解的，第一方面的方法的在本文中描述的合适 相关实施方案也可能是以上刚刚描述的另一方面的方法的优选实施方案，例如优选的配体 可以是例如苄胺，和/或优选的目的牛奶凝固酶可以是例如来源于米黑根毛霉的毛霉胃蛋 白酶；或凝乳酶，其中所述凝乳酶的多肽序列包含与SEQIDNO: 1(骆驼凝乳酶）的成熟多 肽具有至少90%序列同一性的序列，所述成熟多肽是从SEQIDNO: 1的氨基酸位置59到氨 基酸位置381。
[0053] 定义
[0054] 本文相关术语的所有定义都与本领域技术人员关于本文中的相关技术背景所理 解的内容一致。
[0055] 术语"酶"是指具有酶活性的酶，即活性酶。举例来说，当酶是牛奶凝固酶（例如 凝乳酶）时，活性可以是以国际牛奶凝固单位（IMCU)表示的实测牛奶凝固活性（C)。所 述活性可通过标准方法（IS011815IDF157,2007)测定，其描述通过裂解K-酪蛋白的 Phel05_Metl06键或附近的键使牛奶聚集的能力。
[0056] 术语"聚糖"是指多糖或低聚糖。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物，并且可 以是线性的或分支的。聚糖也可以用于指例如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖等复合糖的碳水化 合物部分。
[0057] 术语"糖苷酶"（也称为糖苷水解酶）是指催化糖苷键结/键的水解的酶，糖苷键 是一类将碳水化合物（糖）分子接合到另一个基团（其可以是另一个碳水化合物，也可以 不是另一个碳水化合物）上的共价键。使N连接型聚糖部分地或完全地去糖基化的糖苷酶 在本文中可以被称为N连接型糖苷酶。类似地，使0连接型聚糖部分地或完全地去糖基化 的糖苷酶在本文中可以被称为O连接型糖苷酶。
[0058] 术语N连接型糖苷酶是所属领域中明确定义的术语，并且本领域技术人员知晓具 体目的糖苷酶是或不是N连接型糖苷酶。
[0059] 类似地，术语0连接型糖苷酶是所属领域中明确定义的术语，并且本领域技术人 员知晓具体目的糖苷酶是或不是〇连接型糖苷酶。
[0060] 糖苷酶在本文中也可以被称为去糖基化酶。
[0061] 术语"糖基化"是将聚糖连接到蛋白质、脂质或其它有机分子上的酶促过程。
[0062] 术语"N连接型聚糖"是指通常被连接到天门冬酰胺或精氨酸侧链的氮上的聚糖。
[0063] 术语"0连接型聚糖"是指通常被连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟基赖氨酸或羟 脯氨酸侧链的羟基氧上，或例如神经酰胺等脂质的氧上的聚糖。
[0064] 术语"多肽"涉及通过肽键结合在一起的氨基酸的单个线性聚合物链。
[0065] 术语"糖基化形式的多肽"是含有共价连接到多肽侧链上的低聚糖链（聚糖）的 多肽。碳水化合物通过共翻译修饰或翻译后修饰被连接到多肽上。这在本文中可以替代性 地被称为"糖多肽"。
[0066] 术语"蛋白质"涉及由一个或多个氨基酸链组成的相对较大的生物分子。如所属 领域中所理解的，蛋白质是多肽的一个实例。
[0067] 术语"