一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合 体系的建立方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌是公认的安全级（GenerallyRegardedAsSafeOrganisms，GRAS) 微生物，是动物消化道中的优势益生菌群；乳酸杆菌对动物有益，可以产生乳酸菌素 Lactocidin，Lactacin，Acidophilucin以及Acidocin等活性物质，并通过生物诘抗、改善 动物肠道的生态环境及提高动物免疫力等机制发挥其作用。同时，乳酸菌具有诸多特性，如 能够分泌细胞表面疏水物质和胞外基质分子、基因操作方便、来源于动物消化道的乳酸杆 菌还有很好适应消化道复杂内部环境的能力等，已成为表达外源基因的理想宿主。
[0003]目前乳酸杆菌的基因工程操作技术还不成熟，已报道的无抗性标记基因整合手 段主要利用cre-loxP系统进行筛除抗性基因。此方法存在一定弊端：在筛除抗性利用 cre-loxP系统筛除抗性基因时，在宿主菌基因组中保留有一个loxP位点，这可能会引起许 多突变，如截短、点突变，蛋白融合等。
[0004]pheS基因是苯丙氨酰-tRNA合成酶a亚基编码基因，该基因的一个点突变基 因（GCC-GGC)编码的PheS突变蛋白质（Ala-Gly)能够氨酰化苯基丙氨酸类似物，如 对-氯-苯丙氨酸（P-Cl-Phe)，这些氨酰化的苯基丙氨酸类似物会插入细胞蛋白而对对宿 主菌有毒性致死作用。因此，可利用pheS基因作为反向筛选基因，以对-氯-苯丙氨酸作 为负向筛选底物建立细菌基因组无痕编辑技术体系，目前该技术已被用于粪肠球菌和变形 链球菌基因编辑系统。
[0005] 由于PheS蛋白在细菌中是高度保守，因此，基于pheS点突变基因的细菌基因组编 辑技术具有广泛的应用潜力。
[0006] 采用pheS点突变基因为反向筛选基因在Lactobacillusreuteri中进行基因插 入的技术以及整合体系构建的方法国内未见有相关报道。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建 立方法及其应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为： 一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，包括如下步骤： 51、 根据Genebank中公布的罗伊乳酸杆菌pheS基因序列设计特异引物，然后以罗伊乳 酸杆菌L.reuteriXNY基因组DNA为模板扩增得到L.reuteriXNY的pheS基因； 52、 利用软件将Lactobacillusreuteri的pheS基因与其它细菌的pheS基因进行比 对，确定基因突变位点，再设计点突变引物利用重叠PCR技术获得pheS基因的点突变基因 pheSM; 53、 选取目的基因插入位点，以罗伊乳酸杆菌L.reutcriXNY基因组DNA为模板 PCR扩增获得插入位点上下游700bp同源臂片段LR和RR;然后扩增启动子片段P、红霉 素抗性基因EM片段，再利用重叠PCR技术将其与pheSM基因和同源臂片段连接，得到 LR-P-pheSM-EM-RR整合框架； 54、 将LR-pheSM-EM-RR整合框架电转化至L.reuteriXNY感受态细胞，利用红霉素抗 性筛选得到pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌； 55、 利用重叠PCR技术将所需插入的目的基因与插入位点两端的同源臂序列连接， 得到目的基因整合框架，再将其电转化至PheSM基因重组罗伊乳酸杆菌感受态细胞，利用 对-氯-苯丙氨酸（P-Cl-Phe)抗性筛选即可获得无抗性标记的目的基因整合菌株。
[0009] 其中，所述步骤S1中所述的pheS基因特异引物序列为： a：ATGGGACTAAGAGAGAAATTAG d：TTATCCTTTCTGGTCAAATTGG 其中，所述步骤S2中所述的pheS基因点突变引物序列为：c：ATACGGCGGTTTTGGCTTTGGACTTGGACC b：GGTCCAAGTCCAAAGCCAAAACCGCCGTAT 其中，所述步骤S2中所述的pheSM基因是pheS基因第312位Arg突变为Gly的点突 变基因：GCC312GGC。
[0010] 其中，所述步骤S3中所述的基因插入位点是罗伊乳酸杆菌基因组中的任意位点。
[0011] 其中，所述步骤S4中所述的pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌具有红霉素抗性、 p-Cl-Phe敏感性。
[0012] 其中，所述步骤S5中所述的目的基因整合菌株具有p-Cl-Phe抗性，对红霉素敏 感。
[0013] 其中，所述步骤S5中所述的利用p-Cl-Phe抗性筛选目的基因整合菌株的浓度为 25mM〇
[0014] 其中，pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌，是将构建的LR-P-pheSM-EM-RR整合框架电 转化至L.reuteriXNY感受态细胞，涂布于含有红霉素的MRS平板后，筛选获得的具有红霉 素抗性的双交换转化子（图3)。此次交换是将pheSM基因和红霉素抗性基因整合到基因 组上，获得的重组菌具有红霉素抗性、P-Cl-Phe敏感性；目的基因整合菌株，是将构建基因 整合框架电转化至pheSM基因重组罗伊乳酸杆菌感受态细胞，涂布于含有p-cl-phe的MRS 平板后，筛选获得的具有p-cl-phe抗性的双交换转化子（图4)。此次交换是将目的基因与 pheSM基因和红霉素抗性基因交换并整合到基因组上，获得的重组菌具有p-cl-phe抗性、 红霉素敏感性。
[0015] 本发明具有以下有益效果： 本发明建立的基于PheS负向筛选标记基因的罗伊乳酸杆菌基因整合技术体系，可将 目的基因整合到宿主菌基因组的任意位点，不引入任何冗余序列到宿主菌基因组中，避免 了冗余片段引起的突变；利用该整合体系可以在同一菌株的任意位点进行多次染色体基因 插入；本发明的有益之处还在于该技术体系可用于宿主菌染色体基因无痕敲除和替代。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实施例中不同细菌pheS基因编码蛋白序列比对结果； 图中，丨为pheS基因突变位点。
[0017] 图2为本发明实施例中pheS点突变基因pheSM构建示意图。
[0018] 图3为本发明实施例中pheSM基因重组菌构建示意图。
[0019] 图4为本发明实施例中目的基因重组菌构建示意图。
【具体实施方式】 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细 说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0021] 本发明实施例提供了一种罗伊乳酸杆菌无抗性标记基因整合体系的建立方法，包 括如下步骤： 51、 根据Genebank中公布的罗伊乳酸杆菌pheS基因序列设计特异引物，然后以罗伊乳 酸杆菌L.reuteriXNY基因组DNA为模板扩增得到L.reuteriXNY的pheS基因；所述的 pheS基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，所述的pheS基因特异引物序列为： a：ATGGGACTAAGAGAGAAATTAG d：TTATCCTTTCTGGTCAAATTGG 52、 利用软件将Lactobacillusreuteri的pheS基因与其它细菌的pheS基因进行比 对，确定基因突变位点，再设计点突变引物利用重叠PCR技术获得pheS基因的点突变基因 pheSM;所述的pheS基因点突变引物序列为： c：ATACGGCGGTTTTGGCTTTGGACTTGGACC b：GGTCCAAGTCCAAAGCCAAAACCGCCGTAT 53、 选取目的基因插入位点，以罗伊乳酸杆菌L.reuteriXNY基因组DN