一种评价人口腔黏膜细胞基因组稳定性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种评价细胞基因组稳定性的方法，具体涉及一种评价人口腔黏膜细胞基因组稳定性的方法，该方法是通过采集少量口腔黏膜细胞，制备成单细胞悬液，通过计数不同类型细胞及细胞中的各种遗传损伤指标，对人口腔黏膜基因组健康进行检测和评估，属于细胞遗传及分子生物技术领域。
【背景技术】
[0002]基因组的稳定状态是关乎个体健康状况的最基本的物质基础。人体在整个生命进程中常受到辐射、重金属污染、不当的膳食和不良生活习惯等因素的影响，从而导致基因组稳定性下降，并构成潜在负面健康风险。基因组稳定性下降与许多人类遗传-环境疾病如:出生缺陷、免疫缺陷和退行性疾病(如老年性痴呆、帕金森氏病、高血压、心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症、肿瘤等)危险度增加相关。通过检测人口腔黏膜细胞基因组损伤来评估个体基因组稳定状态，为优化个体基因组健康状态提供基础数据。
[0003]口腔黏膜基因组稳定性分析(Buccal mucosa genomic stability assay, BMGS)是一种集遗传损伤，细胞增殖、分化以及细胞死亡评估为一体的基因组稳定性分析体系，涉及染色体断裂、染色体丢失、染色体不分离、细胞坏死以及凋亡等生物学途径，比单纯的微核分析体现了更宽泛的遗传和细胞损伤机制。该技术体系有两类不同的基因组稳定性标志:(I)遗传损伤标志:微核(MN)(图l，cd)和核芽(NBud)(图l，ef) ; (2)细胞增殖状态和死亡生物标记，包括基底细胞(BS)(图，a)、分化细胞(DF)(图，b)、双核细胞(BN)(图，g)、以及染色质凝聚(CC)(图，h)、核固缩(PN)(图，i)、核溶解(KL)(图，j)、核破裂(KH)(图，
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[0004]MN是遗传损伤综合评价的一个终端标志，是染色体断裂或染色体分离异常，在核分裂后期滞后、未进入子细胞核而游离于胞质中形成的小块染色质。
[0005]NBud是细胞排除过多扩增的DNA的一种机制，起源于基因异常扩增或DNA修复复合体的排除NBud以一种柄状染色质结构凭借核质桥与细胞内的主核相连接是基因异常扩增的生物标记。丽、NBud分别代表不同遗传损伤的端点，但是这二者的形成彼此相关联，共同反应了基因组的损伤状况。
[0006]口腔粘膜基底层的基底细胞有活跃的分裂能力，能不断分裂并维持上皮增殖、补充表层衰老或损伤脱落的细胞。BMGS中基底细胞和双核细胞所占的比例能反映口腔上皮组织的这种再生能力；细胞在上一轮核分裂后胞质分裂受阻可形成双核细胞，双核细胞中往往出现高频率的染色体不分离现象，故双核细胞比例可作为非整倍体发生率的生物标志。
[0007]在细胞死亡的生物学途径里，核破裂表明核的片段化和核最终的分解，属于细胞凋亡的晚期阶段；染色质凝聚则是细胞凋亡的早期表征；核固缩是核物质高度浓缩但有别于染色质凝聚和核破裂的一种核分解形式；核溶解则可能是细胞死亡进程的最后一个时期所呈现的细胞形态。
[0008]基因组稳定性下降与出生缺陷、免疫系统缺陷、退行性疾病如老年性痴呆、帕金森氏病、高血压、心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症、肿瘤等疾病相关。个体暴露于遗传毒性物质或微营养物质的摄入不均衡都可能诱发基因组稳定性下降，BMGS是分析评估人口腔黏膜细胞中基因组稳定性的较好方法，为优化个体基因组健康状态提供基础数据。
[0009]现有技术多为疾病易感性基因的检测。通过检测只是让个体有知情权，了解个体的患病风险高低，并不能作出改变或校正。而本发明是对个体整个基因组健康状况的检测，并在了解个体遗传背景状况的基础上，对可以通过营养干预、调整饮食和生活方式，使遗传损伤较高的个体得到校正，利于其基因组稳定性的维护，优化个体基因组的健康状态，同时降低相关疾病，特别是退行性疾病的患病风险，目前在国内还没有相关技术。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种评价人口腔黏膜细胞基因组稳定性的方法。
[0011]为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是:
[0012]a.一种评价人口腔黏膜细胞基因组稳定性的方法，其主要包括如下制备步骤:口腔黏膜细胞缓冲液的配制、口腔黏膜细胞的采集、单细胞悬液的制备、细胞涂片及染色镜检和细胞计数；
[0013]b.其中，所述的口腔黏膜细胞缓冲液的配制具体包括:称取1.21g Tris, 37.2gEDTA-二钠，1.2g NaCl，7.2g NaOH完全溶解，用浓盐酸调PH至7.0，定容后，121°C高压灭菌30min，室温密封保存；该方法配制的缓冲液可在室温下保存三个月，超过三月的缓冲液不能再继续使用，需重新配置；
[0014]c.其中，所述的口腔黏膜细胞的采集具体包括:(I)取材前，志愿者先用饮用水洗漱口腔2-3遍，以清除杂物、确保口腔内部清洁；(2)用带柄的小木片在脸颊内侧轻轻刮取黏膜细胞，并将其充分悬浮于装有5-8mL细胞缓冲液的烧杯中得细胞悬浮液；
[0015]d.其中，所述的单细胞悬液的制备具体包括:⑴将细胞悬浮液转入1mL离心管中，581g离心1min ； (2)弃上清，用5mL缓冲液重新悬浮细胞，581g离心1min ； (3)弃上清，再用3mL缓冲液悬浮细胞，用组织匀浆器匀浆3min后，经150目的钢网过滤，将滤液转入干净的离心管中，10g离心1min ; (4)弃上清，用400 μ I缓冲液悬浮细胞，通过血球计数板计数，调整细胞浓度大约至80，000个/mL ;
[0016]e.其中，所述的细胞涂片及染色镜检具体包括:(1)向制好的单细胞悬液中加入DMSO(45-50 μ Ι/mL)作用8-lOmin ； (2)以每孔100-120 μ I悬液加入细胞涂片离心机的小孔，以52g离心5min ； (4)待装片自然风干，卡诺氏固定液(甲醇:冰乙酸=3:1)固定1min ; (5)自然风干后，吉姆萨母液用pH为7.40.lmol/L磷酸缓冲液(A液和B液按比例混合，新鲜配制)按1: 10稀释(通常取3ml的母液加30ml的磷酸缓冲液)，染色15min，分别用自来水、蒸馏水水洗，显微镜下观察，视颜色深浅酌情复染；(6)自然晾干lOmin，用0.2%的亮绿染色20-30S，分别用自来水、蒸馏水涮洗；(7)待2h后用中性树脂封片保存，每个样本以制备3张装片为宜。
[0017]f.其中，所述的细胞计数具体包括:在光学显微镜下(100X)计数1000个细胞中BS、DF、BN、CC、PN、KH、KL的数目，以及2000个正常的BS和DF中MN、NBud的数目；至少2人重复计数后误差在30%以内数据可用；每个个体各指标的频率以千分率计算，实现本评价方法的准确性。
[0018]所述的各类细胞及遗传损伤的计数标准:
[0019]基底细胞计数标准:
[0020]基底细胞是口腔细胞类型中最小的细胞，大约只有分化完全的细胞的1/4?1/3，他们具有以下特征:
[0021](I)相比于分化细胞，基底细胞有较大的核质比例；
[0022](2)细胞质较规整，染色较深为深绿色；
[0023](3)核呈卵圆形，染色均匀；
[0024](4)细胞中会出现丽或者NBud ；
[0025]分化细胞计数标准:
[0026](I)细胞呈多边形，相较于基底细胞有较小的核质比例；
[0027](2)细胞质较大，染色较浅；
[0028](3)核呈卵圆形，染色均匀；
[0029](4)细胞中会出现MN或者NBud ；
[0030]染色质凝聚细胞的计数标准:
[0031](I)细胞呈多边有角状；
[0032](2)核呈现出有条纹的凝聚的核染色质；
[0033](3)染色质凝聚区域核染色加深；
[0034]核破裂细胞的计数标准:
[0035](I)细胞呈多边有角状；
[0036](2)相较于染色质凝聚细胞，核中包含大量的凝聚的染色质；
[0037](3)核中出现大量斑点状的核碎片；
[0038]核固缩细胞的计数标准:
[0039](I)细胞呈多边有角状；
[0040](2)核极度缩小，只有正常核2/3-1/3 ;
[0041](3)核致密染色加深；
[0042]核溶解细胞的计数标准:
[0043](I)细胞呈