一种鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明属于功能肽制备技术领域，具体涉及一种鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽。
【背景技术】
[0002]近几十年来，由于臭氧层的破坏、过度日光浴等原因使皮肤光老化人群增多。由紫外线引起的皮肤松弛、粗糙、萎缩、皱纹、色素沉着、毛细血管扩张、紫癜等严重影响了人们皮肤的健康，预防和延缓皮肤光老化已成为目前医学研究的热点。
[0003]皮肤光老化与真皮层胶原含量的减少密切相关，紫外线照射产生过多的R0S，破坏了体内氧化还原系统的平衡，诱导基质金属蛋白酶(Matrix Metallo ProteinasesMMPs)水平升高，导致了真皮层胶原蛋白的降解。
[0004]目前主要通过药物、激光、注射填充、手术等方法进行光老化皮肤的治疗和改善。国内外报道了许多天然动植物提取物具有抗氧化、延缓皮肤光老化的效果，但其含量少、利用率低、作用效果不明显。通过化学方法合成的具有抑制金属蛋白酶活性的多肽成本高。因此，开发抗皮肤光老化作用效果明显、来源广泛的抑制基质金属蛋白酶效果的天然活性物质成为现在研究的热点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种具有抑制基质金属蛋白酶活性的多肽，具有减缓由于紫外线而导致的皮肤氧化损伤的功效。
[0006]本发明的抑制基质金属蛋白酶活性的多肽，其制备方法如下:
[0007]I)鱼皮明胶的制备
[0008]将鱼皮在碱液中进行浸泡，浸泡结束后，水洗鱼皮至中性，然后再用酸溶液在室温浸泡，浸泡结束后水洗鱼皮至pH为5.0-6.0，再将处理的鱼皮放入蒸馏水中，在40°C -80°C水浴振荡提取；离心取上清液，得到鱼皮明胶；
[0009]所述的鱼皮为鳕鱼皮和/或大马哈鱼皮；
[0010]所述的碱液为0.02-0.2mol/L的NaOH溶液；
[0011 ] 所述的酸溶液为0.01-0.06mol/L的&504溶液
[0012]2)基质金属蛋白酶拮抗肽的靶向酶解
[0013]将步骤I)制备的鱼皮明胶调节初始pH至7.2-7.5，采用胰酶和碱性蛋白酶组合进行水解，酶解至产物的水解度为18% _19%，终止酶解反应，离心分离，上清液即为基质金属蛋白酶拮抗肽的粗组分；
[0014]其中胰酶浓度优选为1200U/g.prot，碱性蛋白酶浓度优选为1000U/g.prot ；
[0015]3)基质金属蛋白酶措抗肽的精制纯化
[0016]步骤2)制备的粗组分经0.22 μπι的微孔滤膜过滤后，超滤得到分子量300_1000Da的活性肽；然后采用SP-S^hadex C25阳离子交换柱进行分离纯化:首先以0.02mol/LpH4.2的醋酸缓冲液平衡100-150min，上样后再用0-1.0moI/L的NaCl的醋酸缓冲液线性梯度洗脱，收集活性最高的第二个主峰；然后利用Sephadex G25凝胶柱进一步分离纯化，洗脱液为超纯水，流速0.4-0.6mL/min，收集第二个主峰，脱盐后冷冻干燥，即为MMPs拮抗肽。
[0017]本发明制备的多肽用于制备抑制基质金属蛋白酶活性的制品。
[0018]本发明提供的基质金属蛋白酶拮抗肽能显著的抑制由紫外线照射而引起的皮肤中MMP-1、MMP-3、MMP-9的升高，减缓了紫外线导致的皮肤氧化损伤。另外以鱼皮制备的MMPs拮抗肽可充分利用大量水产加工副产物资源，减少环境污染，具有重要的社会效益。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020]以解冻后300克大马哈鱼皮为原料，经0.lmol/L NaOH溶液(1: 6w/v)室温浸泡30分钟后水洗至中性，用0.0211101/1的!12304溶液(l:6w/V)常温浸泡约30分钟，水洗至pH5.5。按照料液比1:2-1:6 (w/v)加入蒸馏水，60°C水浴振荡提取4小时，离心取上清液，大马哈鱼皮明胶。
[0021]调整大马哈鱼皮明胶溶液浓度20g/L，pH为7.3，采用胰酶和碱性蛋白酶(由地衣芽孢杆菌2709所产的蛋白酶)组合进行水解，胰酶浓度为1200U/g.prot，碱性蛋白酶浓度1000U/g.prot，在50°C下酶解，酶解过程采用酶传感器与人工神经网络在线控制，酶解120min后，每隔2min采用定量栗将酶解液栗入生物传感器，利用谷氨酸和赖氨酸的氧化酶电极进行检测。以游离谷氨酸增加量(μ g/g.总氮)、游离赖氨酸增加量(μ g/g.总氮)输入到训练好的模型，明胶水解度达到18.4%，沸水浴灭酶Smin终止水解反应，离心分离，得到基质金属蛋白酶拮抗肽的粗组分。
[0022](I)基质金属蛋白酶拮抗肽的粗组分经0.22 μπι的微孔滤膜过滤后，分别采用截留分子量100Da和300Da的卷式超滤膜进行超滤。(2)采用SP-S^hadex C25阳离子交换柱(3.5cmX80cm)进行分离纯化:先以0.02mol/L ρΗ4.2的醋酸缓冲液平衡120min，采用NaCl的醋酸缓冲液线性梯度洗脱，收集第二个峰。(3)利用Sephadex G25凝胶柱(1.6cmX 100cm)进一步分离纯化，洗脱液为超纯水，流速0.5mL/min，收集第二个主峰，脱盐后冷冻干燥，得到主要特征片段为Gly-Pro的大马哈鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽。
[0023]采用SPF级ICR雌鼠作为受试动物，随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对照组，大马哈鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽组，构建紫外线诱导的小鼠皮肤光老化模型。实验照射剂量及方式:各组小鼠在紫外照射实验开始前，预防性灌胃2周，第3周开始脱毛，灌胃半小时后进行紫外照射，其中正常组只灌胃不进行紫外照射。造模实验结束后，取小鼠背部同一区域皮肤制备10%组织匀浆上清液，参照试剂盒操作说明分别测定皮肤组织匀浆上清液中ΜΜΡ-1、ΜΜΡ-3、ΜΜΡ-9和蛋白含量，T-S0D、GSH-Px和CAT的活力。大马哈鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽对紫外线照射而导致的MMP-1、MMP-3、MMP-9含量升高的抑制率分别为33.05%,40.83%和39.95%。此外，大马哈鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽使皮肤中抗氧化物酶T-S0D，CAT和GSH-Px的平均活力分别提高34.60%,82.32%和49.76%，使脂质过氧化产物MDA的含量降低了 38.09%，减缓了紫外线导致的皮肤氧化损伤。
[0024]实施例2
[0025]以200g新鲜鳕鱼皮为原料，经0.05mol/L NaOH溶液(料液比1: 6w/v)室温浸泡40min，水洗至中性，0.03mol/L的比304溶液(l:6w/v)室温浸泡约30min，水洗至pH6.0。按照料液比1:4(w/v)加入蒸馏水，65°C水浴振荡提取5小时，离心取上清液，得到鳕鱼皮明胶。
[0026]调整鳕鱼皮明胶溶液浓度为20g/L，调节初始pH至7.5，采用胰酶和碱性蛋白酶(由地衣芽孢杆菌2709所产的蛋白酶)组合进行水解，胰酶浓度为1200U/g.prot，碱性蛋白酶浓度1000U/g.prot，在50°C下酶解，酶解过程采用酶传感器与人工神经网络在线控制，酶解120min后，每隔2min采用定量栗将酶解液栗入生物传感器，利用谷氨酸和赖氨酸的氧化酶电极进行检测。以游离谷氨酸增加量(μ g/g.总氮)、游离赖氨酸增加量(μ g/g ?总氮)输入到训练好的模型，明胶水解度达到18.6%，沸水浴灭酶Smin终止水解反应，离心分离，得到鳕鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽的粗组分。
[0027](I)基质金属蛋白酶拮抗肽的粗组分经0.22 μπι的微孔滤膜过滤后，分别采用截留分子量100Da和300Da的卷式超滤膜进行超滤。(2)采用SP-S^hadex C25阳离子交换柱(3.5cmX80cm)进行分离纯化:先以0.02mol/L pH4.2的醋酸缓冲液平衡120min，上样后用NaCl的醋酸缓冲液线性梯度洗脱，收集第二个峰。(3)利用Sephadex G25凝胶柱(1.6cmX 100cm)进一步分离纯化，洗脱液为超纯水，流速0.4mL/min，收集第二个主峰，脱盐后冷冻干燥，得到主要特征片段为Gly-Pro的鳕鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽。
[0028]采用SPF级ICR雌鼠作为受试动物，随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对照组，鳕鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽组，构建紫外线诱导的小鼠皮肤光老化模型。实验照射剂量及方式:各组小鼠在紫外照射实验开始前，预防性灌胃2周，第3周开始脱毛，灌胃半小时后进行紫外照射，其中正常组只灌胃不进行紫外照射。造模实验结束后，取小鼠背部同一区域皮肤制备10%组织匀浆上清液，参照试剂盒操作说明分别测定皮肤组织匀浆上清液中MMP-1、MMP-3、MMP-9和蛋白含量，T-SOD, GSH-Px和CAT的活力。鳕鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽对紫外线照射而导致的MMP-1、MMP-3、MMP-9含量升高的抑制率分别为
36.73%，31.34%和44.24%。此外，鳕鱼皮源基质金属蛋白酶拮抗肽使皮肤中抗氧化物酶T-S0D, CAT和GSH-Px的平均活力分别提高34.07%,90.85%和77.64%,使脂质过氧化产物MDA的含量降低了 30.36%，减缓了紫外线导致的皮肤氧化损伤。
【主权项】
1.一种抑制基质金属蛋白酶活性的多肽，其特征在于，所述的多肽的制备方法如下: 1)鱼皮明胶的制备 将鱼皮在碱液中进行浸泡，浸泡结束后，水洗鱼皮至中性，然后再用酸溶液在室温浸泡，浸泡结束后水洗鱼皮至pH为5.0-6.0，再将处理的鱼皮放入蒸馏水中，在40°C -80°c水浴振荡提取；离心取上清液，得到鱼皮明胶； 2)基质金属蛋白酶拮抗肽的靶向酶解 将步骤I)制备的鱼皮明胶调节初始PH至7.2-7.5，采用胰酶和碱性蛋白酶组合进行水解，酶解至产物的水解度为18% _19%，终止酶解反应，离心分离，上清液即为基质金属蛋白酶拮抗肽的粗组分； 3)基质金属蛋白酶拮抗肽的精制纯化 步骤2)制备的粗组分经0.22 μ m的微孔滤膜过滤后，超滤得到分子量300-1000Da的活性肽；然后采用SP-S^hadex C25阳离子交换柱进行分离纯化:首先以0.02mol/L pH4.2的醋酸缓冲液平衡100-150min，上样后再用0-1.0moI/L的NaCl的醋酸缓冲液线性梯度洗脱，收集活性最高的第二个主峰；然后利用Sephadex G25凝胶柱进一步分离纯化，洗脱液为超纯水，流速0.4-0.6mL/min，收集第二个主峰，脱盐后冷冻干燥，即为MMPs拮抗肽。2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步骤I)中的鱼皮为鳕鱼皮和/或大马哈鱼皮。3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步骤I)中的碱液为0.02-0.2mol/L的NaOH溶液。4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步骤I)中的酸溶液为0.01-0.06mol/L 的 H2SO4溶液。5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步骤2)中胰酶浓度为1200U/g.proto6.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的步骤2)中碱性蛋白酶浓度为1000U/g.proto7.权利要求1所述的多肽在抑制基质金属蛋白酶活性中的应用。8.权利要求1所述的多肽在制备抑制基质金属蛋白酶活性的制品中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种抑制光老化皮肤中基质金属蛋白酶活性多肽的制备方法，以鱼皮为原料，利用碱性蛋白酶和胰酶组合酶建立酶传感器-人工神经网络在线监控模型控制水解的进程使水解度在18％-19％，酶解液经0.22μm的微孔滤膜过滤后采用卷式超滤膜进行超滤截留分子量在300-1000Da的活性肽，最后采用SP-Sephadex？C25阳离子交换柱和Sephadex？G25凝胶柱进行逐级分离纯化，冷冻干燥得到主要特征片段为Gly-Pro基质金属蛋白酶(MMPs)拮抗目标肽。本发明制备的鱼皮明胶来源的生物活性肽能够显著的抑制由紫外线导致的皮肤中MMPs含量的升高，并且呈现较好的抗氧化活性，为以鱼皮明胶为原料制备具有抗皮肤光老化活性的生物活性肽的开发利用提供了更广阔的前景。
【IPC分类】C12P21/06
【公开号】CN105087735
【申请号】CN201510603619
【发明人】侯虎, 陈铁军, 樊燕, 李八方, 陆姣含, 王石开, 司磊磊
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月21日