重组表达人呼吸道合胞病毒f1蛋白胞外区的方法及表达系统的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒学和生物工程领域；更具体地，本发明涉及重组表达人呼吸道合 胞病毒Fl蛋白胞外区的方法及表达系统。
【背景技术】
[0002] 人呼吸道合胞病毒能够感染婴儿、小孩与老人等免疫力低下群体；引起上呼吸道 感染，出现咳嗽、流涕与发烧等感冒样症状，并且还能造成婴幼儿的下呼吸道感染，引起细 支气管炎、哮喘与肺炎等疾病，严重时危及生命。
[0003] 因为该病毒能够诱导感染细胞形成合胞,故名为人呼吸道合胞病毒。F蛋白在感染 过程中分裂形成Fl与F2两个功能性亚单位，辅助病毒感染细胞；同时F蛋白决定该病毒主 要的免疫原性。其中Fl蛋白起着主要作用，从分子量上占据了 80%的F蛋白，它包含有胞 内区、胞膜区与胞外区，直接介导病毒与细胞的融合，胞外区包含了主要的F蛋白抗原决定 簇，主导F蛋白与该病毒的免疫原性。
[0004] 现有技术中，对于人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的重组表达主要集中在原核系统表 达，但是原核表达系统的缺陷是易于产生包涵体，经历变复性步骤之后使得蛋白的三级结 构产生破环。而应用真核系统进行表达的一般方法并不易于成功表达。因此，本领域有必 要研究开发有利于表达Fl蛋白（包含其抗原决定簇）的方法，从而为后续制备疫苗或抗病 毒制剂奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供重组表达人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区的方法及表达 系统。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种重组表达人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区的方 法，包括：利用果蝇S2细胞作为表达宿主，表达人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区；其中，所 述的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区的氨基酸序列如SEQIDN0:4所示。
[0007] 在一个优选例中，利用果蝇S2细胞作为表达宿主表达人呼吸道合胞病毒Fl蛋白 胞外区的方法包括：
[0008] (1)提供表达载体，所述的表达载体中含有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区的表 达盒；
[0009] (2)将（1)的表达载体转化果蝇S2细胞，培养转化有所述表达载体的重组果蝇S2 细胞，从而表达人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区。
[0010] 在另一优选例中，所述的表达盒中包括SEQIDN0:3所示的核苷酸序列。
[0011] 在另一优选例中，所述的表达载体是果蝇表达载体，如pMT质粒，更具体地如pMT/ BIP/V5-His-A〇
[0012] 在另一优选例中，培养转化有所述表达载体的重组果蝇S2细胞包括：以大于 2XIO6细胞/ml的接种量将重组果蝇S2细胞接种于培养基中，28 土rC培养，待细胞密度达 至IJIXIO7细胞/ml后，补加培养基；待细胞密度再次达到IXIO7细胞/ml后，以诱导剂CdCl2 诱导培养。
[0013] 在另一优选例中，诱导培养后还包括：收集细胞培养液，离心收集培养上清液，亲 和层析纯化。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区，其氨基酸序列 如SEQIDNO:4 所示。
[0015] 在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的人呼吸道合胞病毒Fl蛋 白胞外区。
[0016] 在一个优选例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO: 3中第2-1132位所 /Jn〇
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含所述的多核苷酸。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种重组果蝇S2细胞，其包含所述的表达载体，或其 基因组中整合有所述的多核苷酸。
[0019] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0020] 图1、截短的hRSV-Fl-lcDNA PCR扩增结果。
[0021] 图2、截短的hRSV-Fl-1基因与pMT/BIP/V5-His-A重组质粒PCR鉴定结果。
[0022] 图3、转染截短的hRSV-Fl-1的S2细胞培养上清的western blot鉴定。
[0023] 图4、转染截短的hRSV-Fl-2的S2细胞培养上清的western blot鉴定。第1道 是Marker，第2道是转染细胞1没有诱导，第3道是转染细胞1有诱导，第4道是转染细胞 2没有诱导，第5道是转染细胞2有诱导。
[0024] 图5、稳转细胞株细胞培养上清液Western Blot分析结果。
[0025] 图6、左图：人截短的hRSV-Fl-1蛋白大量纯化考马斯亮蓝结果（第1-2道是S2 表达其他蛋白上清的纯化对照图，第3道是Markerl，第4道是截短的hRSV-Fl-1的纯化对 照图，第5道是Marker2)。右图；人截短的hRSV-Fl-1蛋白大量纯化WesternBlot结果 (泳道3为Marker,泳道1、2为纯化时往柱子加入洗脱缓冲液以后的第一管与第二管流出 液（各2ml)各条带大小如图标示）。
【具体实施方式】
[0026] 本发明揭示了一种截短型的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的真核表达方法，使用本 方法可以实现人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的大规模生产和纯化，为针对呼吸道合胞病毒的 疫苗、治疗性抗体研究提供了研制基础。
[0027] 如本文所用，所述的"截短型的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白"、"人呼吸道合胞病毒 Fl蛋白胞外区"、"人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区"、"hRSV-Fl-1"可互换使用，均指 具有SEQIDN0:4氨基酸序列的多肽。
[0028] 本发明提供了人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区。鉴于现有技术中难以真核表达 人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的状况，本发明人进行了深入的研究，制备了多种人呼吸道合胞 病毒Fl蛋白的截短体的编码基因，本发明人意外地发现，编码SEQIDN0:4多肽的序列能 够实现在果蝇S2细胞中成功表达，而比该序列更长的截短体基因则无法成功表达。
[0029] 因此，本发明提供了编码所述的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区的分离的 核酸，也可以是其互补链。编码本发明人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区的DNA序列， 可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。
[0030]在获得了编码带有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区的DNA序列之后，将其连 入合适的表达载体，再转入果蝇S2细胞。最后通过培养转化后的细胞，通过分离纯化得到 带有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区。
[0031] 因此，本发明还提供了包含编码所述带有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区 的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序 列，以便于所述带有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区的表达。"操作性相连"或"可操 作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部 分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
[0032]在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于真核表达的载体，可参考 如Pouwels等，克隆载体：实验室手册（Elsevier最新版）中所描述的。可选用本领域已知 的各种载体如市售的载体。在本发明的一种实施方式中，所述的载体为适用于转化果蝇S2 细胞的载体。
[0033]此外，含有编码所述带有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外区的核酸序列的重 组细胞也包括在本发明中。在本发明中，所述的"重组细胞"是果蝇S2细胞。用重组DNA转 化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
[0034]本发明提供了重组表达人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区的方法，所述方法包括： 利用果蝇S2细胞作为表达宿主，表达人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外区。
[0035]对比诸如CHO等哺乳动物细胞表达系统，本发明提供的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白 胞外区的真核表达系统可以方便的用于工业化大规模生产，具有产量高、过程监控容易、质 量控制容易与成本低廉等优点。
[0036] 对比诸如E.coli等原核表达系统，本发明提供的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外 区的真核表达系统得到的目的蛋白由于具有真核表达系统特有的糖基化修饰，与人呼吸道 合胞病毒感染后子代病毒携带的Fl蛋白拥有类似的天然构象，具有更好的生物学活性，能 够为后续试验研究提供有力的支撑。
[0037] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0038] 实施例1、人呼吸道合胞病毒截短Fl蛋白cDNA的PCR扩增
[0039] 1)根据NCBIGenBank核酸数据库提供的人呼吸道合胞病毒（hRSV)A2毒株基因组 的基本信息：HumanrespiratorysyncytialvirusstrainA/ffI/629-3/06-07,Sequence ID:gbIJF920069.I，并获取其DNA序列。
[0040] 2)从步骤I)获得的DNA序列中截取所需要的Fl基因截短片段（相对于 GenBank:JX198138. 1提供的全长Fl基因序列，截短片段位于全长核苷酸序列序列的第 1946-3077位），位于全长氨基酸序列的第153-529位），获得相对应DNA序列；另外根据果 蝇S2 表达系统（DrosophialExpressionSystem)使用的表达载体pMT/BIP/V5-His_A(购 自英骏公司）的多克隆位点的相应性质，选择合适的酶切位点；再以获取的序列为模板，加 上选取的酶切位点，设计用于PCR的上下游引物，引物序列如下（注：下划线分别表示EcoR I和XholI酶切位点）：
[0041]if向引物：5' -CGGAATTCTGCTGTATCTAAGGTCCTGC-3'(SEQIDNO:5)；
[0042] 反向引物：5' -CGCTCGAGAGTAGTTATCATGATATTTGTGGTG-3'(SEQIDN0:6)。
[0043] 3)以从ATCC购得的人呼吸道合胞病毒标准株A2为模板，因为hRSV为逆转录病 毒，借用逆转录获得cDNA;再利用Phusion高保真酶，结合已经设计的引物，以PCR方法获 取截短的hRSV-Fl-1基因片段，具体PCR体系配比与反应程序如下（参照《分子克隆实验指 南》方法使用上述特异性引物对截短的hRSV-Fl-1进行扩增）：
[0044]i.PCR体系总体积：50U1
[0049] 4)PCR产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳法进行，所用凝胶为1%琼脂糖凝胶，分子 量标记为购自TaKaRa公司的DL2,OOODNAMarker(D501A)，电泳结果如图1所示。
[0050] 5)再通过胶回收的方法回收提取目的基因片段，即截短的hRSV-Fl-1回收产物。 截短的hRSV-Fl-1基因具有SEQIDN0:3所示序列，编码SEQIDN0:4所示的蛋白。
[0051] 采用如前所述的方法，申请人还制备了截短的hRSV-Fl-2基因产物，该基因具有 SEQIDNO: 1所示序列（