通过移码位点上游调控因子来控制核糖体阅读框改变效率以调控真核基因表达的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种通过标靶移码位点上游调控因子，以调控真核基因表达的方法。 更特别地，本发明关于一种通过控制位于程序性核糖体移码（PRF，programmedribosomal frameshifting)位点上游的双螺旋结构形成，来调控真核基因表达的方法。
【背景技术】
[0002] 自然界已发现，动态的RNA构型交替转变可以调控具有RNA-依赖性的细胞功 能。此调控作用通过在RNA所介导的特定功能性平台内，调控特别的RNA结构形成来 达成（Dethoff，E.A.etal.,Nature482,322-330,2012)。已知原核细胞会利用核糖 开关（Riboswitch，一种对代谢物产生感应的RNA分子），来调控用于回应养分变化的 特殊基因表达的转录终止或翻译启动（Henkin,T.M.Genes&Dev. 22, 3383-3390, 2008 ; Mandal,M. &Breaker,R.R.NatureRev.Mol.CellBiol. 5, 451-463, 2004) 〇
[0003] 过去已有许多找寻一种能够在原核及真核细胞系统中，引发由核糖开关介导的基 因表达的化学结构的尝试（Deigan，K.E.等人，Acc.Chem.Res.44，1329-1338,2011)。然 而在哺乳类细胞中核糖开关应用方面的成功案例则很有限，这可能与哺乳动物系统使用 与原核细胞不同的机制来终止转录作用，及启动翻译作用有关。此外在真菌与植物中所 发现由TPP核糖开关执行的另类剪接（splicing)调节作用（Cheah，M.T.etal.，Nature 447, 497-500, 2007)，也暗示其他由RNA介导的基因表达平台，或可提供较佳用于建构成功 的真核细胞核糖开关的架构。
[0004] -1程序性核糖体移码（PRF)会促使翻译延长阶段中的核糖体往mRNA的5'端-方 向位移一个核苷酸，导致在解码时产生一个-1阅读框改变。有效的-IPRF需要一段滑动序 列（即，发生框架位移之处），以及置于其下游的刺激子结构（通常是一种假结结构）。反 之，+IPRF会促使翻译延长阶段中的核糖体往mRNA的3'端-方向位移一个核苷酸，导致在 解码时产生一个 +1 阅读框改变（Farabaugh,P.J.，Microbiol.Rev. 60, 103-134, 1996)。
[0005] 最近的结果显示，原核细胞来源的经改造的代谢物-感应性RNA假结，在网状 红血球细胞溶解产物中可以具有配体-特异性的-1程序性核糖体移码（-1PRF)的活 性。虽然这些成功的例子，暗示调节翻译阅读框改变可作为一种运用于改造哺乳类细胞 核糖开关的表达平台，但其一般应用则仍因为难以鉴定出专一的配体-感应性的-IPRF 假结而受到阻碍（Chou，M.Y.等人RNA16，1236-1244,2010;Yu，C.H.等人403〇16111. Biol. 8, 733-740, 2013)。
[0006] -IPRF对于数种人类病毒病原能在宿主内有效进行复制而言是相当重要的，且已 被认为是一种抗病毒标靶（Hung,M.等人J.Virol. 72, 4819-4824, 1998)。通过可阻断-IPRF 刺激子功能性的配体作用来抑制病毒的-1PRF，病毒的移码位点下游-IPRF刺激子结构因 此可作为一种有效的药物标靶。所述的配体可为能与该刺激子结构专一结合的有机分子 (Park.S.-J.etal,J.Am.Chem.Soc.133,10094-10100, 2011)，或是可破坏该刺激子结构 的反义序列（Ahn，D.-G.etal,AntiviralRes.91, 1-10,2011)。使用反义序列来祀定下 游刺激子结构的可能缺点在于，mRNA与反义序列之间所形成的双螺旋结构，当被放置于移 码位点的下游时，本身会刺激-IPRF(Olsthoorn，R.C.L.等人，RNA10, 1702-1703, 2004 ; Howard,M.T.etal.RNA10, 1653-1661，2004)。我们先前的研究已显示，位于-IPRF滑动点 上游的发夹结构可以减弱-IPRF效率。而减弱效率由发夹结构安定性及其与滑动点的距 离来决定。此外，当发夹结构置于+1移码位点的上游时，也能够刺激酵母菌的+1PRF，表示 位于移码位点上游近端的安定发夹结构确实也是一种核糖体阅读框改变的调节子（Cho,C. P.等人，PLoSONE8,e62283, 2013)。
[0007] 需注意的是，此类共-翻译再折叠RNA发夹结构让人联想到，原核细胞系统中可调 节与P-无关的转录终止效率的共-转录再折叠RNA发夹结构，我们因此推论该调节性移 码位点上游发夹结构可能可以，以与原核细胞转录终止作用中的发夹结构类似的方式受到 调控。因此意味着，除了使用下游配体-感应性假结刺激子之外，通过配体-依赖性调节上 游减弱子发夹结构形成，也可提供另类建构具有配体-感应性的-IPRF调节回路的方法。
[0008] 在试图解析上游发夹结构在核糖体阅读框改变的调节作用中所扮演的角色的过 程中，同时发现与-IPRF移码位点上游mRNA序列互补的反义序列，也可减量调节-IPRF活 性，此暗示被解旋后再形成的发夹主干部位为调节翻译轨道移转的功能性决定位。因此， mRNA中近端稳定的发夹结构以及由反式作用的反义序列介导的双螺旋结构，当其被置于紧 邻移码位点上游近端时，可作用为阅读框改变的调节子。相反地，核糖体移码位点上游由 mRNA与原核16S核糖体RNA之间的内部Shine-Dalgarno(SD)-反SD交互作用所介导的短 双螺旋结构，可刺激原核细胞的-1及+IPRF(Weiss,R.B.等人，EMBOJ. 7, 1503-1507, 1988 ; Larsen,B.等人，J.Bacteriol. 176,6842-6851，1994)。然而，在真核细胞翻译系统中并未 发现SD-反SD交互作用的存在。
【发明内容】
[0009] 本发明的一方面关于一种标靶位于移码位点上游的调节元件来调节真核细胞基 因表达的组成物，其包含调控于核糖体移码位点上游的双螺旋结构形成的配体分子。
[0010] 在本发明的一些具体实施形式，所述的调节真核细胞基因表达的组成物包含：一 种配体-敏感性RNA元件，来调节上游-1程序性核糖体移码减弱子发夹结构的形成。在本 发明的一些具体实施形式，所述的真核细胞为植物细胞。在本发明的其他具体实施形式，所 述的真核细胞为哺乳动物细胞。
[0011] 在本发明的一些具体实施形式，所述的调控PRF上游调节性发夹结构形成包括， 增进或抑制该发夹结构的形成。在本发明的一项具体实施例，所述的程序性核糖体移码 为-1PRF。在本发明的另一项具体实施例，所述的程序性核糖体移码为+1PRF。
[0012] 在本发明的一项具体实施例，所述的阅读框改变的调节作用可通过一种与移码位 点上游的mRNA序列互补，而形成上游双螺旋结构的反义序列来达成。
[0013] 在本发明的一项具体实施例，所述的配体为一种与位于基因的mRNA中的PRF上游 调节性发夹结构形成序列互补的反义序列。在本发明的另一项具体实施例，所述的配体为 一种与位于基因的mRNA中的PRF上游调节性发夹结构形成序列相结合的分子。
[0014] 在本发明的又一项具体实施例，所述的配体为一种与位于基因的mRNA中的PRF上 游调节性发夹结构形成序列相结合的RNA-结合蛋白。在本发明的另一项具体实施例，所述 的配体为一种与位于基因的mRNA中的PRF上游调节性发夹结构形成序列相结合的有机化 合物。
[0015] 在另一方面，本发明关于一种调节真核细胞蛋白质翻译过程中核糖体移码效率的 方法，包含将真核细胞与一种用于调节PRF上游调节性双螺旋结构元件形成的分子接触。 在本发明的一些具体实施形式，所述的真核细胞为植物细胞。在本发明的其他具体实施形 式，所述的真核细胞为哺乳动物细胞。
[0016] 在本发明的一项具体实施例，所述的分子为一种RNA-结合蛋白。在本发明的另一 项具体实施例，所述的分子为一种有机化合物。在本发明的又一项具体实施例，所述的分子 为一种反义序列。
[0017] 本发明的有益效果为：
[0018] 本发明揭露的用于调节上游-IPRF减弱子或+IPRF刺激子的配体的概念、设计及 应用，证明共-翻译再折叠RNA发夹结构对于核糖体阅读框改变调控的配体-依赖性调节 潜能，可从旁避开对于寻找配体_感应性假结的需求。
[0019] 此