3t3-l1前脂肪细胞系的诱导分化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂肪细胞诱导领域，具体而言，涉及3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化 方法。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的提高，肥胖及其相关疾病的发病率日益增加，由此而造成的 家庭及社会经济负担不断加重。脂肪细胞代谢及功能紊乱是导致肥胖的核心机制之一，有 关脂肪细胞的研究已成为目前研究热点。在体外研究中，脂肪细胞模型是研究脂肪代谢及 其功能的重要工具。
[0003] 3T3-L1前脂肪细胞系源于小鼠胎盘的成纤维细胞群，细胞形态上类似成纤维细 胞，呈长梭形。研究发现它是一种能够增殖并在一定条件下向脂肪细胞分化的前体细胞。目 前，现已成为诱导分化为脂肪细胞最为常用的细胞系。
[0004] 对3T3-L1前脂肪细胞系而言，传统诱导方法是在3T3-L1前脂肪细胞融合2天后， 用加入含IBMX、地塞米松、胰岛素的培养基培养2天，后续再用含胰岛素的培养基培养2天， 之后采用普通高糖DMEM培养基培养，此种方法既往称之为"鸡尾酒"诱导法。随着研究的 深入，发现传统"鸡尾酒"诱导法存在诱导周期长、脂肪细胞转化率低且不均匀等缺点。此 外，该诱导法还会受细胞的代数以及细胞培养皿类型的影响。如此以来，难以为研究者提供 数量一致、分化稳定的脂肪细胞。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，脂肪细胞转 化率稳定，不受细胞代数及细胞培养皿类型的影响。其中，在在不同类型细胞培养器皿中诱 导的脂肪细胞的转化率误差在5%以内。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] 3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，包括以下步骤：
[0009] (a)、3T3_L1前脂肪细胞系经复苏，培养，传代后，至长满培养基，继续培养36-48 小时后进行诱导分化；
[0010] (b)、所述诱导分化为：加入含有诱导剂的含10%胎牛血清的高糖DMHM培养液，培 养72-96小时；其中，所述诱导剂各成分在所述高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松 0? 9-1.IyM，IBMXI.OmM，胰岛素L8-2. 0yM;
[0011](c)、加入含有1. 8-2. 0yM胰岛素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续诱导 48-96小时；之后每48小时换液一次，换液为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，自加入 诱导剂起第8-10天成熟脂肪细胞可用。
[0012] 本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系诱导分化方法，参照传统"鸡尾酒"诱导法，通 过延长诱导剂作用时间发现，该法可缩短整个3T3-L1前脂肪细胞系的诱导过程，且脂肪细 胞转化率稳定，不受细胞代数及细胞培养皿类型的影响。其中，在不同类型细胞培养皿诱导 的脂肪细胞的转化率误差在5%以内。
[0013] 优选地，所述复苏为：
[0014] 从液氮中取出细胞株，立即置于37±2°C水浴中，至细胞液完全溶解时取出，于室 温1000-1200rpm离心3-5min，弃去上清，加入培养液，吹打重悬，将细胞悬液加入培养器皿 中，然后将所述培养器皿置于5% ±1%CO2的37±2°Cf旦温培养箱中培养。
[0015] 该复苏方法得到的细胞受伤害少，成活率高，减少了细胞的死亡率，也尽量避免了 死细胞对活细胞生长的影响。
[0016] 进一步地，所述培养液为含10% ±2%小牛血清和1% ±0. 1%青链霉素的高糖 DMEM培养液。该培养液进行培养细胞，不易被杂菌污染，并且细胞处于较低营养成分的生长 环境中；后续通过营养成分更多的胎牛血清诱导，诱导效果更好。
[0017] 为了利于细胞生长，更进一步地，所述细胞悬液的细胞浓度为IX105-6XlO5A/ ml〇
[0018] 为了保持细胞良好的生长状态，优选地，所述培养为：每36-48小时更换1次培养 液。
[0019] 进一步地，更换培养液时，沿壁加入培养液。以使培养液充分滋养细胞，防止培养 液对细胞造成损害。
[0020] 优选地，细胞密度为75% -85 %时进行所述传代。该细胞密度的细胞生长旺盛，传 代效果好。
[0021 ] 进一步地，所述传代具体为：移去培养液，用PBS溶液洗2-3次，加入胰蛋白酶消化 28-35s，终止消化，吹打后，1000-1200rpm离心3-5min，去上清，加入培养液，吹打使细胞分 散；取含有细胞的培养液加入孔板，置于5% ±1% 0)2的37±2°C恒温培养箱中培养。
[0022] 控制孔板中的细胞数目，来进一步控制细胞的生长状态，以提升转化率。进一步 地，孔板中的细胞浓度为3X105-5XIO5个/ml。
[0023] 为了便于培养，为后续的试验提供转化率稳定的成熟的脂肪细胞，进一步地，所述 诱导分化在6-10cm培养皿或6-64孔板中的任一种中进行。如可以为6cm培养皿、IOcm培 养皿、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、64孔板等等。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0025] (1)本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，通过延长诱导剂作用时 间，缩短整个分化过程，该法脂肪细胞转化率稳定，数量一致，可为研究者提供稳定的脂肪 细胞模型。
[0026] (2)本发明通过首先采用含小牛血清培养3T3-L1前脂肪细胞控制细胞的生长状 态，后续的诱导剂则采用含胎牛血清的培养基培养，可有效促进脂肪细胞转化。
[0027] (3)本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，其诱导分化不受细胞代 数及细胞培养皿类型的影响，其中，不同类型细胞培养器皿中脂肪细胞的转化率误差在5 % 以内。
[0028] (4)本发明，整个诱导过程耗时8-10天即可将3T3-L1前脂肪细胞成功诱导为成熟 脂肪细胞，而传统"鸡尾酒"法则需要12-14天时间。
【附图说明】
[0029] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0030] 图1为本发明实施例1提供的诱导剂作用时间为2天得到的成熟的3T3-L1脂肪 细胞的油红〇染色结果图；
[0031] 图2为为本发明实施例1提供的诱导剂作用时间为3天得到的成熟的3T3-L1脂 肪细胞的油红〇染色结果图；
[0032] 图3为为本发明实施例1提供的诱导剂作用时间为4天得到的成熟的3T3-L1脂 肪细胞的油红〇染色结果图。
【具体实施方式】
[0033] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售获得的常规产品。
[0034] 配置以下溶液：
[0035] 1、4, 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX)配制。分子量222,几乎不溶于水，现 配现用，〇.22iim过滤除菌；母液（50mmol/L) :11.5mgIBMX+940iil超纯水+60yllmol/L KOH。用法：每Iml完全培养基中加入IOul母液，终浓度为I.OmM/L。
[0036] 2、胰岛素溶液配制。比较难溶，-20°C保存1个月，使用pH2~3的稀盐酸溶液助 溶，0.22 111]1过滤除菌。母液（111^/1111):1〇11^1吧+1〇11110.011]1〇1/1^11〇1。
[0037] 3、地塞米松溶液配制。分子量516. 41，0. 22ym过滤除菌，-20°C保存1个月。使 用无水乙醇溶解，母液（lmmol/L) :lmg溶于25ml无水乙醇。
[0038] 4、0ilred工作液：将0. 5g油红0加入100mL异丙醇，得到母液，4°C避光保存；使 用时以母液与蒸馏水以体积比为3:2进行混合，用滤纸过滤后即为Oilred工作液。
[0039] 下面以6孔板、IOcm培养皿和6cm培养皿进为例行详细说明，但并不限于这些孔的 培养板，如还可以为12孔板、24孔板、48孔板、64孔板以及更多孔的板等等。
[0040] 实施例1
[0041] 3T3-L1前脂肪细胞系的复苏：从液氮中取出细胞株，立即置于37±2°C水浴箱中， 至细胞液完全溶解时取出，于室温1000 rpm离心5min，弃去上清，加入培养液，吹打重悬，将 重悬的细胞及培养液吸入培养皿中，显微镜下观察细胞形态及数量，使细胞悬液以3XIO5 个/ml加入培养器皿中，然后将所述培养器皿置于5% ±1% 032的37±2°Cf旦温培养箱中 培养；其中，培养液为含10%小牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM培养液；
[0042] 3T3-L1前脂肪细胞系的培养：显微镜下见细胞贴壁，呈梭行，透亮，细胞每3天更 换1次培养液，倾斜培养皿，将培养液用移液管移去，沿壁加入培养液；
[0043] 3T3-L1前脂肪细胞系的传代：显微镜下见细胞贴壁，呈梭形或多角形，细胞密度 约80%，倾斜培养皿，将培养液用移液器移去，沿壁加入温热的PBS溶液6ml，晃动培养皿 后，用移液器移去，重复一次，加入Trypsin进行消化，显微镜下见细胞由不规则多角形或 梭形收缩成圆形，过程约30秒，加入培养液终止消化，用移液器吹打，使细胞脱离培养皿 底，吸入离心管中，1000 rpm离心4min，倾去上清，加入培养液，吹打使细胞分散，细胞浓度 达到1〇5;取含有细胞的培养液分别加入到3个6孔板中，分别置于5% ± 1 %CO2的37±2°C 恒温培养箱中培养，长满培养基，继续培养3天后均进行诱导分化；
[0044] 3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化：加入含有诱导剂的10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液，三个6孔板分别培养2天、3天和4天；其中，诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中 的终浓度为：地塞米松I. 0yM，IBMXI.OmM，胰岛素I. 9yM;显微镜下见少数细胞呈圆形， 并有脂滴出现；
[0045] 继续诱导：加入含有I. 9yM胰岛素和10%体积百分数胎牛血清的高糖DMEM培养 液继续诱导3天；之后每48小时换液一次，换液为普通高糖DMEM培养基。
[0046] 将培养好的不同诱导分化时间的细胞用显微镜观察其生长状态，显微镜下见细胞 基本呈圆形，细胞内含有多个较大的脂滴，即分化为成熟的脂肪细胞。
[0047] 将培养好的不同诱导分化时间的细胞用油红染色，油红染色步骤如下：
[0048] (1)移去培养液，沿壁缓慢加入PBS2ml，冲洗后移去，重复2次；
[0049] (2)用10%甲醛固定液固定细胞1小时；
[0050] (3)PBS2ml冲洗 3 次，移去PBS;
[0051] (5)加入油红0染液，使染料全部覆盖细胞表面，放置IOmin;
[0052] (8)倒置显微镜下观察结果，取不同诱导天数的6孔板中的处于中间诱导转化率 的细胞