湖羊催乳素基因snp位点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及湖羊催乳素基因SNP位点及其应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 湖羊原产于太湖流域，具有母性好、泌乳性能强和性成熟早的特点。又因其多产多 胎的性状，现已成为国内肉羊杂交改良的优良品种。近年来，对绵羊遗传育种的研究主要 集中在对其经济性状功能基因的多态性研究，对于产奶性能的相关研究相对较少。但是， 伴随着该羊种多产多胎，营养相对不足、母羊泌乳力低下，从而导致羔羊发育不良，抵抗 力低下，存活率下降，使得多胎多产的优势未能发挥。因此本试验拟从分子遗传基础入 手，研究高繁殖力湖羊泌乳基因，以期发现控制绵羊泌乳量大小的标记基因，为绵羊分子育 种提供技术支撑。
[0003] 研究表明不同种类的绵羊乳中的化学元素基本相同，但其产奶量受到遗传、胎次、 环境（V.M.Russo2013)、年龄、营养水平、日照、带幼畜数目、生理状态、挤奶方式等因素的 影响。家畜的泌乳性状是一个数量性状，是由多基因控制的，近年来对于泌乳基因的研究主 要集中在牛上。催乳素基因（PRL)的主要功能是促进哺乳动物个体的乳腺发育、乳汁生成、 发动和在维持泌乳方面发挥重要作用。因此，PRL基因被视为对家畜泌乳性能具有重要作 用的候选基因。绵羊催乳素（PRL)基因全长为8468bp，含有5个外显子和4个内含子。
[0004] 泌乳性状是一种典型的由多种微效基因控制的数量性状，是绵羊近年来研究较少 的性状。目前国内外对催乳素基因的组织结构、作用机理及其与泌乳量等繁殖性状的关系 仍知之甚少，还需对这几方面做大量的探索工作，以期为提高绵羊繁殖力的高效育种提供 一条新的途径。因此，如何得到湖羊催乳素基因的SNP位点，以提高湖羊泌乳量或者是湖羊 泌乳性状，是本领域亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供湖羊催乳素基因SNP位点及其应用。为了实 现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0006] 本发明涉及湖羊催乳素基因SNP位点，其特征在于所述的SNP位点位于PRL基因 序列上。
[0007] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的SNP位点为PRL4591位点、PRL1228位点、 PR2351位点和/或PR4591位点。
[0008] 在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的PRL4591位点为CC型。
[0009] 本发明还涉及一种湖羊催乳素基因，其特征在于所述的基因PRL4591位点为CC 型、PRL1228位点为AC型、PR1039位点为AA型、PR2351位点为AA型或GG型和/或PR4591 位点为CC型。
[0010] 本发明另一方面还涉及上述湖羊催乳素基因SNP位点在湖羊育种中的应用。
[0011] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的应用是在提高泌乳量或改善湖羊泌乳性 状中的应用。
[0012] 本发明通过研究湖羊催乳素基因SNP位点，对于提高泌乳量或改善湖羊泌乳性状 具有显著的意义。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明的技术内容进行详细描述。
[0014] 1材料和方法
[0015] 1. 1试验动物表型数据收集及血样采集
[0016]在乌鲁木齐米东区塞外银铃种羊场随机挑选胎次（1-2)、年龄、体况、预产期、营养 状况等基本一致的泌乳期湖羊41只。实验动物主要饲喂豆科和禾本科草，集中补充一次 精料。羊群均圈养，自由采食和饮水。静脉采取血样，肝素钠抗凝，_2〇°C保存。
[0017] 乳的收集和乳成分的测定：生产后的第4天（让羔羊尽量吃完初乳）20点，将羊羔 和母羊隔离后，采用人工泌乳的方式挤完乳汁，次日凌晨7点，13点30分，20点分别测定母 羊的泌乳量。测定日将采集的乳样早、中、晚各取25ml混匀后一20°C冷冻保存送实验室。
[0018] 采用丹麦进口的F0SS5000系列测试仪对样品进行检测，其中Integratemilk TestingTMFossmatic5000 用于测定乳成分，IntegratedMilkTestingTMMilkoScan FT4000用来测定体细胞数。测定指标包括乳蛋白率（％ )、乳脂率（％ )、乳糖率（％ )、总固 体等。
[0019] 1. 2基因组DNA的提取
[0020]采用酚-氯仿法提取湖羊的基因组DNA，灭菌，TE溶解稀释后-20°C保存。用分光 光度计检测DNA纯度，然后稀释成50ng/y1备用。
[0021] 1.3PCR引物和试剂
[0022] 根据GenBank上公布的羊催乳素基因序列（GenBank登录号NW_004080183. 1)， 利用引物设计软件Primer5. 0设计引物（表1)，由上海生工合成；蛋白酶K、taq酶均购自 Takara公司，酚、氯仿、乙醇均购自济南化学试剂公司。
[0023] PCR反应体系及反应条件
[0024]PCR反应体系：10Xbuffer(含Mg2+)5yL，10pmol上下游引物各 2. 5yL，TaqDNA聚 合酶 3U，dNTPs(2. 5umol/L) 5yL，DNA1yL，加超纯水至 50yL。
[0025] 采用梯度PCR对所用引物进行扩增，确定每对引物的最适退火温度。PCR的反应条 件：95°C预变性5min;94°C变性30s，52-62°C退火45s，72°C延伸l_2min，总共35个循环； 72°C延伸5min。4°C保存。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物。
[0026] 1. 5统计分析
[0027] 采用BioEdit、Mega6. 0和Chromas对测序所获得PRL基因的序列和峰图进行比 对，检测SNP位点。用SPSS13. 0统计软件统计数据，利用固定模型分析PRL基因型对产奶 性状的遗传效应。对所测的湖羊不同基因型的性状差异进行显著性检验。
[0028] 表1PRL全基因引物
[0029]
[0030]
[0031] 1. 6PRL基因PCR结果
[0032] 采用梯度PCR对引物的退火温度进行筛选，挑选PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳 检测，结果显示，条带清晰，无引物二聚体，特异性好，后送上海生工测序。
[0033] 1. 7SNP位点筛查
[0034] 使用Bioedit整理上海生工返回的PRL基因序列数据，用MEGA6. 0进行比对。使 用Chromas查看峰图，找出23个SNP位点。
[0035] 将PRL基因单个SNP位点基因型与湖羊泌乳期泌乳性状进行关联分析后发现：仅 PR4591位点与泌乳量有关，其他4个位点均与泌乳性状相关。结果如表2-6。
[0036] 表2湖羊PR4244位点与泌乳量的显著分析
[0037]
[0038] 表3湖羊单个SNP位点与泌乳性状的相关性分析
[0039] 表3湖羊催乳素基因PR1228位点与泌乳性状的相关性分析
[0040]
[0041] 表4湖羊催乳素基因PR1039位点与泌乳性状的相关性分析
[0042]
[0043] 表5湖羊催乳素基因位PRL2351点与泌乳性状的相关性分析
[0044]
[0045] 表6湖羊催乳素基因位PR4591点与泌乳性状的相关性分析
[0046]
[0047]
[0048]由表2、3、4、5、6、可以看出，湖羊有共有4项生长性状与SNP位点相关，表现在 SNP位点上有统计学意义。PRL4591位点CC型在第八周泌乳量显著高于AA型（P〈0. 05); PRL1228位点AC型后期乳脂率极显著高于CC型（P〈0. 01)，中期总固体AC型显著高于CC 型（P〈0. 05) ;PR1039位点AA型前期乳脂率极显著高于AC型和CC型；PR2351位点AA型 和GG型中期乳脂率显著高于AG型（P〈0. 05)，AA型中期蛋白率极显著高于AG型和GG型， AA型和AG型极显著高于GG型（P〈0. 01) ;PR4591位点CC型早期乳脂率极显著高于AA型 (P〈0. 01)，后期蛋白率和中期总固体CC型极显著高于AA型（P〈0. 01)。
[0049] 以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。对一般领域的技术人员而言，在不背离本发明实质精神的前提下 对它所做的任何显而易见的改动，都将构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责 任。
【主权项】
1. 湖羊催乳素基因SNP位点，其特征在于所述的SNP位点位于PRL基因序列上。2. 根据权利要求1所述的SNP位点，所述的SNP位点为PRL4591位点、PRL1228位点、 PR2351位点和/或PR4591位点。3. 根据权利要求1所述的SNP位点，其特征在于所述的PRL4591位点为CC型。4. 一种湖羊催乳素基因，其特征在于所述的基因PRL4591位点为CC型、PRL1228位点 为AC型、PR1039位点为AA型、PR2351位点为AA型或GG型和/或PR4591位点为CC型。5. 上述湖羊催乳素基因SNP位点在湖羊育种中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，所述的应用是在提高泌乳量或改善湖羊泌乳性状中的 应用。
【专利摘要】本发明公开了湖羊催乳素基因SNP位点及其应用，所述的SNP位点为PRL4591位点、PRL1228位点、PR2351位点和PR4591位点。本发明通过研究湖羊催乳素基因SNP位点，对于提高泌乳量或改善湖羊泌乳性状具有显著的意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105063037
【申请号】CN201510524900
【发明人】史洪才, 牛志刚, 李晓林, 袁燕, 王珊, 王美玲
【申请人】新疆畜牧科学院生物技术研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月25日