一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法，属于生物 工程领域。
【背景技术】
[0002] 精氨酸脱羧酶（Argininedecarboxylase，ADC，EC4. 1. 1. 19)是依赖磷酸吡咳醛 (PLP)的一类酶，广泛存在于细菌、植物、动物和人类中。大肠杆菌中的ADC有两种形式： BiodegradativeADC(由AdiA编码）和BiosyntheticADC(由speA编码），Biodegradative ADC在含精氨酸的营养丰富的强酸性培养条件下诱导产生，其主要作用是调控系统的pH 值。BiosyntheticADC在较宽范围的pH条件下表达。
[0003] 胍基丁胺是Biosynthetic ADC(EC 4. 1. 1. 19)催化精氨酸脱羧基的产物，是一种 多胺，具有降血压、抗抑郁、抗炎、镇痛、抑制细胞增生等多种生理功能，是重要的医药中间 体。
[0004]目前，Agm的工业化生产主要依赖化学合成，是用1，4一丁二胺和S-甲基异硫脲反 应，或用1，4一二溴丁烷与邻苯二甲酰亚胺钾反应制得，主要以硫酸盐的形式存在。由于化 学合成法存在生产步骤多，收率低，成本高，环境污染等问题，因而ADC酶转化法正在日益 受到重视，酶转化法具有具有清洁、快速、高效等优势，被认为是极具应用潜力的方法。
[0005]目前报道的表达精氨酸脱羧酶的重组菌，存在比酶活低的缺陷。同时已有的利用 固定化细胞转化生产胍基丁胺的报道存在转化时间长、效率低的问题。
【发明内容】
[0006] 为了克服以上问题，本发明提高了一种高产精氨酸脱羧酶的重组菌及其在转化生 产胍基丁胺方面的应用。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种高产精氨酸脱羧酶的重组菌，所述重组菌以 E.coli BL21(DE3)为宿主、pET20b(+)为表达载体，表达来源于Escherichia coli BL21的 精氨酸脱羧酶基因speA。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶基因speA的氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种利用所述的重组菌生产精氨酸脱羧酶的方法，是 将重组菌种子液接种至发酵培养基，培养至0D_为0. 7,然后加入终浓度为0. 4mmol/L的 IPTG诱导 4h。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为S0C培养基。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种所述重组菌在生产胍基丁胺方面的应用。
[0012] 所述应用是先诱导重组菌产精氨酸脱羧酶，然后以精氨酸为底物，全细胞转化生 产胍基丁胺；所述全细胞转化中，底物精氨酸浓度为15_25g/L，转化温度为35-40°C，转化 时间4-7h。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化中，菌体细胞添加量为2. 5_4g/ L(以细胞干重计，DCW)。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述菌体细胞添加量为3. 5g/L，底物精氨酸浓度为 20g/L，转化温度为35-40°C，转化时间6h。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述诱导重组菌产精氨酸脱羧酶是将重组菌培养至 0D6。。为0.7,然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导4h。该条件下酶活可达0.53Umgi。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化是在缓冲体系中进行，缓冲液为 Tris-HCl(pH7. 0,辅酶PLP浓度为 30mM，Mg2+浓度为 4mM)。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述应用具体是：将重组菌株培养至0D6。。为0.7,用 终浓度为〇. 4mmol/L的IPTG诱导表达4h，然后收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体，再将 该菌体投入转化液中进行转化，其中转化条件为：底物精氨酸浓度为20g/L，细胞添加量为 3. 5g/L，转化温度为35-45°C，转化时间6h，摇床转速150rpm。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明的重组菌，精氨酸脱羧酶的比酶活可达0.53Umgi。利用本发明的重组菌， 全细胞转化精氨酸生产胍基丁胺，转化6h的胍基丁胺的产量可达14. 3g/L，生产强度可达 2. 38gAL?h)，转化率可达为95. 6%。本发明方法简单、易操作，适合工业化生产。
【附图说明】
[0020] 图1 :酶法转化L-精氨酸生产胍基丁胺示意图；
[0021] 图2 :胍基丁胺标准品和转化产物高效液相色谱图；其中A标准品，B转化产物。
【具体实施方式】
[0022] 转化产物验证及胍基丁胺产量检测：
[0023] 以胍基丁胺硫酸盐作为标准品配置标准溶液。将适度稀释的转化上清液和标准溶 液分别与0PA衍生，经0. 22um微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定胍基丁胺含量。
[0024] 高效液相色谱条件：
[0025]色谱柱：Acclaim120C18 (250mmX4. 6mmX5ym) ?
[0026] 流动相：流动相A:10mMKH2P04缓冲液（pH5. 3);流动相B:乙腈-甲醇-10mM KH2P04 (体积比为5:3:1)，用0. 22um滤膜过滤；
[0027] 柱温：35°C
[0028] 检测波长：激发波长330nm，发射波长465nm;
[0029] 进样量：12ul(8y1样品+4y1 0PA衍生剂）；
[0030] 流速：lml/min。
[0031] 精氨酸脱羧酶酶活测定方法：
[0032]在 2mL反应体系中，添加 50mMTris-HCLbuffer(pH7. 5)，ImMPLP，0.ImMDTT， 4mMMgS04,lOmML-Arg，40°C水浴，加入200yL菌体细胞破碎液后开始反应，15min后加入 1/5体积40%三氯乙酸终止反应。用HPLC测定产物胍基丁胺含量。1个酶活力单位（U)定 义为：在40°C，pH7. 5条件下，每min生成lumol胍基丁胺所需的酶量为1个酶活力单位。 实施例1 :表达精氨酸脱羧酶的重组菌株的构建
[0033] (1)用弓丨物 1:5，-CATGCCATGGCAATGTCTGACGACATGTCTATG-3，和弓丨物 2:5'-CCCAAGCTTGTTACTCATCTTCAAGATAAGTA-3 '将来自于E.coliBL21 的基因组进行 PCR扩增：扩增体系中加入LAtaq酶，95°C预处理5min，95°C解链30s，55°C退火30s，72°C延 伸2min，30个循环；
[0034] (2)用限制性内切酶NcoI和HindIII将目的基因和表达载体pET-20b⑴37°C酶 切2h;
[0035] (3)用T4连接酶分别将酶切并胶回收后的目的基因和质粒pET_20b⑴16°C连接 l〇h，用化学转化法转入表达菌株E.coliBL21中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中培 养 12h;
[0036] (4)将平板中长出的菌落进行PCR及双酶切验证，测序验证，筛选出阳性克隆子， 获得精氨酸脱羧酶重组菌株。
[0037] 实施例2 :利用重组菌转化L-精氨酸生产胍基丁胺
[0038] 按以下方法生产胍基丁胺：
[0039] (1)将构建的阳性重组菌株接入LB斜面培养基培养12h;
[0040] (2)接一环斜面种子到LB培养基内，培养6h;
[0041 ] (3)将种子液接入S0C发酵培养基内，培养至0D_为0. 7,加入终浓度为0. 4mmol/ L的IPTG进行诱导，4h后收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次；
[0042] (4)将菌体投入转化液中进行转化，其转化条件为：底物精氨酸浓度为20g/L，细 胞浓度3. 5g/L，转化温度为35-45°C，转化时间6h，摇床转速150rpm。
[0043] 然后检测上清中胍基丁胺含量，检测方法：取转化液lOOOOrpm离心2min，收集上 清液，并以胍基丁胺硫酸盐作为标准品，配制标准溶液；将适度稀释后的上清液和标准溶液 分别与0PA衍生，经0. 22um微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定。
[0044] 结果显示，转化6h后，胍基丁胺的产量达到14. 3g/L，生产强度为2. 38gAL?h)， 对底物的摩尔转化率为95. 6%。
[0045] 实施例3 :按以下方法转化L-精氨酸生产胍基丁胺
[0046] 将重组菌培养至0D6。。为0. 7,加入终浓度为0. 4mmol/L的IPTG诱导产酶，然后以 精氨酸为底物，全细胞转化生产胍基丁胺；其中转化条件具体是：底物精氨酸浓度为15g/ L，菌体细胞添加量为2. 5g/L，转化温度为35°C，转化时间5h。
[0047] 经测定，胍基丁胺产量可达10. 4g/L，转化率为93%，生产强度2. 08gAL?h)。
[0048] 实施例4 :按以下方法转化L-精氨酸生产胍基丁胺
[0049] 将重组菌培养至0D6。。为0. 7,然后加入终浓度为0. 4mmol/L的IPTG诱导产酶，然 后以精氨酸为底物，全细胞转化生产胍基丁胺；其中转化条件具体是：底物精氨酸浓度为 25g/L，菌体细胞添加量为4g/L，转化温度为40°C，转化时间4-7h。
[0050] 经测定，转化4h时，胍基丁胺产量可达9. 32g/L、生产强度2. 33gAL*h);转化7h 时，胍基丁胺产量可达11. 4g/L。
[0051] 同时本发明还比较不同转化时间对转化效率的影响，结果显示，转化6h可达到最 大产量和转化率。
[0052] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种高产精氨酸脱羧酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌以E. coli BL21(DE3)为 宿主、pET20b(+)为表达载体，表达来源于Escherichia coli BL21的精氨酸脱羧酶基因 speA〇2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述精氨酸脱羧酶基因speA的氨基酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -种利用权利要求1所述的重组菌生产精氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述方 法是将重组菌种子液接种培养至OD 6。。为0. 7,加入终浓度为0. 4mmol/L的IPTG诱导4h。4. 权利要求1所述重组菌在生产胍基丁胺方面的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是先诱导重组菌产精氨酸脱羧 酶，然后以精氨酸为底物，全细胞转化生产胍基丁胺；所述全细胞转化中，底物精氨酸浓度 为15-25g/L，转化温度为35-40°C，转化时间4-7h。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌体细胞添加量为2. 5-4g/L。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诱导重组菌产精氨酸脱羧酶是将重 组菌培养至OD6。。为0. 7,然后加入终浓度为0. 4mmol/L的IPTG诱导4h。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述全细胞转化中，菌体细胞添加量为 3. 5g/L，底物精氨酸浓度为20g/L，转化温度为35-40°C，转化时间6h。9. 根据权利要求4所述应用得到的胍基丁胺。10. 权利要求9所述胍基丁胺在制备药物方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法，属于生物工程领域。本发明将来源于大肠杆菌Escherichia？coli？BL21中编码精氨酸脱羧酶的基因(speA)过量表达于E.coli？BL21(DE3)中，获得了一株含精氨酸脱羧酶重组菌株pET20b(+)-ADC。该酶在大肠杆菌内诱导表达后，表现出较高的活性。发酵得到的菌体可直接用于转化，通过对转化条件进行优化，在37℃条件下，转化周期仅需要4-6h，胍基丁胺产量达到14.3g/L，转化率为96.5％。本发明清洁安全，转化率高，具有较好的科研价值和工业化应用前景。
【IPC分类】A61P9/12, C12P13/00, C12R1/19, C12N9/88, A61P29/00, C12N1/21, A61P25/24, A61K31/155
【公开号】CN105062943
【申请号】CN201510535382
【发明人】刘立明, 孙霞, 孙安然
【申请人】江南大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月27日