培养人胎盘间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种培养人胎盘间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞是一种未分化的细胞，有西个基本特性，一是具有白我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞，根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类，第一类是全能干细胞(totipotent stem cell),其可以分化为功能一致的全能细胞，可以发育为月台儿，第二类是多潛能干细胞(pturipotent stem cel)，它能够分化为身体中的每种细胞类型，但是不能形成月台盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潛能干细胞的分化港能不是“全体”的，因此不将这种细胞称为“全能”，而且它们不是胚_胎。多潛能干细胞进一步特化为多能(mult iPotent)干细胞，其专用于分化为特定功能特化的特定种系的细胞。多能干细胞能够分化为它们所源自的组织中含有的细胞类型；例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小板。胚月台干细胞(Embryonic stem cell)具有广泛的潜能，能生成除胎盘外的机体所有的组织细胞；第三类是成体干细胞(aduit stemcell)是一种将tF目有终生白我复制(identical copies)和白我更新(self-renewal)能力的未分化细胞，它分布于不同的组织，并可演变成为各种类型的资质细胞。干细胞的分类，主要分为造血干细胞及非造血干细胞。造血干细胞主导_[?1^液、免疫方面的疾病，来源例如脐带血；非造血干细胞则以细胞分化与修复为主，可应用于中风、糖尿病、老年痴呆等再生医学，来源有所带、胎盘。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cell MSC)是可形成多种细胞类型的多能干细胞。间充质干细胞(MSC)最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分高培养操作简使等特点，正日益受到人们的关注。间充质干细胞的应用范国也越来越广泛。日前国内外已开展了多项临床应用研究，主要疾病类型包括骨关节炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GvHD)，脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:提供一种培养人胎盘间充质干细胞的方法，它解决了现有技术存在的易污染、产量低、培养效果差等技术难题。
[0005]本发明是这样实现的:培养人胎盘间充质干细胞的方法，包括如下步骤:
1)使用无菌止血钳剥除胎膜的羊膜层，将胎盘蜕膜部分剪下，放入新的培养皿中，用生理盐水洗涤3次；
2)将剪取剥离好的胎盘蜕膜放入离心管中，每1ml加入含有1ul头孢哌酮钠注射液及两性霉素b抗生素的基础培养液作为组织备份；从胎盘上分离的胎盘蜕膜组织，置于含1ml生理盐水的培养皿中；
3)将上述分离下来的组织胎盘蜕膜组织收集于离心管中，加入45ml生理盐水于50ml离心管中，离心500g/5min，洗涤1_2遍，弃上清，剪碎成I?4mm3大小的组织块；
4)向剪碎的组织块中加入胶原酶II，剪碎的组织块与胶原酶的体积比为1:3 ;充分混匀后，置于恒温振荡器中，温度为37°C，转速为150rpm，时间为Ih ;
5)在反应完成后，加入消化体积3-5倍的生理盐水，充分混匀；将消化后的混合液立刻过滤，并将组织块洗涤1-2次；细胞滤液300g/10min离心，用移液管吸取去掉上清；加入1ml完全培养基，其中含1ul头孢哌酮钠及两性霉素b，吹打后转入培养瓶:
6)壁蜕膜组织按每ImL组织块对应接种I个T75细胞培养瓶，将细胞接种到3个T-75培养瓶中，每瓶含有1mL含抗生素的培养液，其中含1ul头孢哌酮钠及两性霉素b ;将培养瓶水平放入37°C，质量百分比为5%的CO2培养箱中进行原代培养；
7)原代培养24-48h后，进行第一次全量换液，此后每隔3天全量换液一次，放置在培养箱中进行培养；
8)原代培养7-14天后，在原代培养的细胞融合度达到80-90%时，消化收获；收集培养基900g，并进行5min离心；用10-20 mL的生理盐水清洗T-75培养瓶I次；加入质量百分比为0.125%的复温胰酶3mL ;在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下进行4-6min ;
9)将细胞悬液收集到一个50mL离心管中；用10-20mL的生理盐水清洗T-75培养瓶，洗液也收集到该50mL离心管中；用100 μ m细胞过滤器过滤后，300g离心lOmin，去上清，加生理盐水吹匀细胞，定容至20mL混匀，取0.5mL细胞悬液进行计数，其余细胞悬液离心300g/10min ；
10)如果Pl活细胞总数低于1.5xl07，则按上述方法再传代一次；其中活细胞总数包括冻存细胞总数及流式送检数；
11)收集最后离心洗涤上清液，送检需氧菌及真菌、厌氧菌及真菌检测；用适量完全培养基重悬细胞团块，并混合均匀。
[0006]由于采用了以上技术方案，本发明对人胎盘间充质干细胞的培养方法进行优化，采用该方案来培养人胎盘间充质干细胞所获得的产品不易污染，而且产量高，培养成本低。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
【附图说明】
[0007]图1流式细胞检测仪检测胎盘表面标志物。
【具体实施方式】
[0008]本发明的实施例:培养人胎盘间充质干细胞的方法，包括如下步骤:
7)原代培养24_48h后，进行第一次全量换液，此后每隔3天全量换液一次，放置在培养箱中进行培养；
8)原代培养7-14天后，在原代培养的细胞融合度达到80-90%时，消化收获；收集培养基900g，并进行5min离心；用10-20 mL的生理盐水清洗T-75培养瓶I次；加入质量百分比为0.125%的复温胰酶3mL ;在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下进行4-6min ;
9)将细胞悬液收集到一个50mL离心管中；用10-20mL的生理盐水清洗T-75培养瓶，洗液也收集到该50mL离心管中；用100 μ m细胞过滤器过滤后，300g离心lOmin，去上清，加生理盐水吹匀细胞，定容至20mL混匀，取0.5mL细胞悬液进行计数，其余细胞悬液离心300g/10min ；
10)如果Pl活细胞总数低于1.5xl07，则按上述方法再传代一次；其中活细胞总数包括冻存细胞总数及流式送检数；
11)收集最后离心洗涤上清液，送检需氧菌及真菌、厌氧菌及真菌检测；用适量完全培养基重悬细胞团块，并混合均匀。
[0009]经流式细胞术检测，人胎盘MSCS强表达透明质酸受体⑶44和整合素家族成员CD29,阳性率分别为99.8%, 99.7%;不表达造血干细胞标志CD34 (4.8%)、CD45 (0.9%)、⑶14 (1.16%)，也不表达内皮细胞标志⑶106 (2.3%);值得注意的是，人胎盘MSCS不表达与移植物抗宿主病(Graft-versus-hostdisease, GVHD)有关的 HLA-DR(1.0%)和CD40(0.96%)，如图1 所示 ο
[0010]本发明所述并不限于【具体实施方式】中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1.一种培养人胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)使用无菌止血钳剥除胎膜的羊膜层，将胎盘蜕膜部分剪下，放入新的培养皿中，用生理盐水洗涤3次； 2)将剪取剥离好的胎盘蜕膜放入离心管中，每1ml加入含有1ul头孢哌酮钠注射液及两性霉素b抗生素的基础培养液作为组织备份；从胎盘上分离的胎盘蜕膜组织，置于含1ml生理盐水的培养皿中； 3)将上述分离下来的组织胎盘蜕膜组织收集于离心管中，加入45ml生理盐水于50ml离心管中，离心500g/5min，洗涤1_2遍，弃上清，剪碎成I?4mm3大小的组织块； 4)向剪碎的组织块中加入胶原酶II，剪碎的组织块与胶原酶的体积比为1:3 ;充分混匀后，置于恒温振荡器中，温度为37°C，转速为150rpm，时间为Ih ; 5)在反应完成后，加入消化体积3-5倍的生理盐水，充分混匀；将消化后的混合液立刻过滤，并将组织块洗涤1-2次；细胞滤液300g/10min离心，用移液管吸取去掉上清；加入1ml完全培养基，其中含1ul头孢哌酮钠及两性霉素b，吹打后转入培养瓶: 6)壁蜕膜组织按每ImL组织块对应接种I个T75细胞培养瓶，将细胞接种到3个T-75培养瓶中，每瓶含有1mL含抗生素的培养液，其中含1ul头孢哌酮钠及两性霉素b ;将培养瓶水平放入37°C，质量百分比为5%的CO2培养箱中进行原代培养； 7)原代培养24-48h后，进行第一次全量换液，此后每隔3天全量换液一次，放置在培养箱中进行培养； 8)原代培养7-14天后，在原代培养的细胞融合度达到80-90%时，消化收获；收集培养基900g，并进行5min离心；用10-20 mL的生理盐水清洗T-75培养瓶I次；加入质量百分比为0.125%的复温胰酶3mL ;在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下进行4-6min ; 9)将细胞悬液收集到一个50mL离心管中；用10-20mL的生理盐水清洗T-75培养瓶，洗液也收集到该50mL离心管中；用100 μ m细胞过滤器过滤后，300g离心lOmin，去上清，加生理盐水吹匀细胞，定容至20mL混匀，取0.5mL细胞悬液进行计数，其余细胞悬液离心300g/10min ； 10)如果Pl活细胞总数低于1.5xl07，则按上述方法再传代一次；其中活细胞总数包括冻存细胞总数及流式送检数； 11)收集最后离心洗涤上清液，送检需氧菌及真菌、厌氧菌及真菌检测；用适量完全培养基重悬细胞团块，并混合均匀。
【专利摘要】本发明提供了一种培养人胎盘间充质干细胞的方法。本发明对人胎盘间充质干细胞的培养方法进行优化，采用该方案来培养人胎盘间充质干细胞所获得的产品不易污染，而且产量高，培养成本低。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105018421
【申请号】CN201510277006
【发明人】边曙光
【申请人】贵州北科泛特尔生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年5月27日