一种β-羰基羧酸酯还原酶的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用β-羰基羧酸酯类化合物与金属离 子的显色反应，能够快速方便大量的筛选出能够生产β -羰基羧酸酯还原酶的方法，该方 法具有操作方便、快速、准确和通量高等特点。
【背景技术】
[0002] 光学纯手性仲醇是一类重要的化合物，被广泛应用于手性助剂和制药领域。手性 仲醇的合成可通过化学法和生物酶法获得。化学合成手性仲醇需要还原剂、金属催化剂、有 机溶剂，而且副产物多，对环境的污染严重。而生物酶法合成手性醇具有反应条件温和、选 择性高、副反应少、产物比较单一、收率高、光化学纯度、无环境污染等特点。因为其具有独 特的优越性，成为了近年来国内外研究的热点。
[0003] 羰基还原酶可高效催化羰基化合物合成手性仲醇。为扩大羰基还原酶酶源， 许多筛选方法应用于羰基还原酶的筛选。TLC法简单快捷，但其通量较低。分光光度法检测 NADH的减少，其灵敏度较高，但是辅酶价格昂贵，不利于高通量检测。高效气相和高压液相 检测方法，灵敏度高，但是设备费用昂贵，操作繁琐。综上所述，建立一种快速、准确、低成本 和易操作的羰基还原酶筛选方法是非常必要的。本研究小组发现在室温下（25~35 °C )条 件下4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)等β -羰基羧酸酯可与金属离子显色剂发生显色反应，并 在24孔板中建立了羰基还原酶的高通量筛选方法。该方法具有快速、准确、易操作和通量 高等特点。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明提供了所述的重组还原酶菌株大肠埃希氏菌fecAericAia coJi. CCZU-K14,该菌株已于2014年6月13日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1 号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中 心（CGMCC)，保藏号为 CGMCC No. 9298。
[0006] 本发明提供了一种羰基羧酸酯还原酶的高通量筛选方法。其特征在于，利用 4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)及其结构类似物等β -羰基羧酸酯与金属离子溶液发生显色反 应，于510 nm条件下分析。该方法可在24孔板中进行操作，可建立β-羰基羧酸酯还原酶 的高通量筛选方法。在24孔板中筛选显色方法操作步骤如下： (1)称取重组A cWi CCZU-K14静息细胞(湿重）悬浮于磷酸缓冲溶液体系（pH 7. 0， 100 mmol/L)形成10% (质量浓度）的细胞悬液，加入终浓度为500-3000 mmol/L的底物 β -羰基羧酸酯、750-4500 mmol/L的葡萄糖和50 μ mol/L的NAD+混合均匀后在30°C、160 r/min的条件下进行还原转化反应。
[0007] (2)反应结束，加入等体积乙酸乙酯萃取，显色是在24孔板中进行的。萃取液：显 色剂 A (0.04 ~ 0.08 mol/L):显色剂 B (0.1 ~ 0.3 mol/L) =20:800:800 (体积比），在 20~35°C下显色反应15~30 min后取显色反应液至另一 24孔板中，加入9倍体积的无水乙 醇混合均匀，用紫外-可见分光光度计测其在510 nm波长下进行分析。
[0008] 其中步骤（1)所述方法，显色剂 A 为 FeCl3、FeCl2、Fe2 (SO4) 3、FeS04、Fe (ClO4) 3、CoCljP ZnCl2中的一种；显色剂B为HCl、H #04和HClO 4中的一种。
[0009] 本发明的有益效果： 本发明的一种β-羰基羧酸酯还原酶的高通量筛选方法，具有操作方便、快速、准确和 通量高等特点。
[0010]
【附图说明】
[0011] 图I CCZU-K14静息细胞还原4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)[图注：图中1-6为 CCZU-K14静息细胞催化还原500 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)反应进行0、1、 2、3、4、5 h的显色测定结果；图中1'-6'为灭活催化剂与还原反应产物（4-氯-3-羟基丁酸 乙酯）与显色剂的显色结果(空白对照）]。
【具体实施方式】
[0012] 本发明所涉及的验证方法菌株为重组大肠埃希氏菌 Escherichia coli. CCZU-K14,该菌株已于2014年6月13日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号 院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心 (CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 9298。该菌株为一种生产羰基还原酶菌株，可催化底物4-氯 乙酰乙酸乙酯（COBE)合成4-氯-3羟基丁酸乙酯（义构型，e. e.值>99. 9%)。
[0013] 本发明涉及的菌株重组A cWi CCZU-K14具有如下微生物学特征： 1.形态特征： 杆状，周生鞭毛，能运动，无芽孢，大小为0. 5X 1~3 μπι。
[0014] 2.平板固体培养基上的菌落特征（30 °C，24 h): 圆形，1~4 mm ;培养初期表面有光泽、湿润、光滑。
[0015] 3.生长环境 最适生长温度37 °C，最适生长pH 7.0。生长温度范围为15~46 °C。
[0016] 实施例1 :FeCl 3显色液分析 称取A cWi CCZU-K14静息细胞(湿重）悬浮于2 mL磷酸缓冲溶液体系（pH7. 0,100 mmol/L)形成10%(质量浓度)的细胞悬液，加入终浓度为3000 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸 乙酯（C0BE)、4500 mmol/L 的葡萄糖和 300 ymol/L 的NAD+，混合均勾后在 30 °C、160 r/min 的条件下进行还原转化反应15 h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯溶液萃取，进一步在24 孔板中进行显色，萃取液：显色剂A (FeCl3溶液；0. 04 mol/L):显色剂B (HC1;0. 3 mol/L) =20:800:800 (yL: yL: yL)，在20°C下振荡反应30min，显色反应液利用9倍体积的无 水乙醇混匀后，测其在510 nm波长下的紫外吸收值(标准曲线\。__^}=49. 25X0D51(];R2 = 0. 9915)。经计算其转化率为99. 1%，取上清液利用气相色谱法测定其转化率为99. 5%，两种 方法测定结果基本一致，误差〈5%。
[0017] 实施例2:Fe 2 (SO4) 3显色液分析 称取A cWi CCZU-K14静息细胞(湿重）悬浮于2 mL磷酸缓冲溶液体系（pH7. 0,100 mmol/L)形成10% (质量浓度）的细胞悬液，加入终浓度为1000 mmol/L的底物4-氯乙酰乙 酸乙酯（C0BE)、1500 mmol/L的葡萄糖和100 ymol/L的NAD+，混合均匀后在30°C、160 r/ min的条件下进行还原转化反应6 h。反应结束后加入等体积乙酸乙酯溶液萃取，进一步 在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A (Fe2 (SO4)3溶液；0. 08 mol/L):显色剂B (H2SO4; 0.1mol/L)=20:800:800 UL: yL: yL)，在 35°C 下振荡反应 15min，显色反应液利 用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510 nm波长下的紫外吸收值(标准曲线 Ycobe (mm〇i/L) =714. 28 X 0D51Q;R 2=0. 9934)。经计算其转化率为99. 2%，取上清液利用气相色谱法测定其转 化率为99. 8%，两种方法测定结果基本一致，误差误差〈5%。
[0018] 实施例3:Fe (C10 4) 3显色液分析 称取A cWi CCZU-K14静息细胞(湿重）悬浮于2 mL磷酸缓冲溶液体系（pH7. 0,100 mmol/L)形成10% (质量浓度）的悬液，加入终浓度为500 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸乙 酯（C0BE)，混合均匀后在30°C、160 r/min的条件下进行还原转化反应2 h。反应结束后加 入等体积乙酸乙酯溶液萃取，进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A(Fe (ClO4) 3溶 液；0.07 111〇1/1):显色剂8(!1(：104;0.3 111〇1/1)=20:800:800 (41^:41^:41^)，在20°(：下 振荡反应30 min，显色反应液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510 nm波长下的紫 外吸收值（Ycqbe (_1/u=666. 67X0D51Q;R 2=0. 9923)。经计算其转化率为95. 21%，取上清液利 用气相色谱法测定其转化率为96. 56%，误差〈5%。
[0019] 实施例4:底物广泛性分析 利用磷酸缓冲溶液（pH 7. 0, lOOmmol/L)配制A cWi CCZU-K14静息细胞悬浮液（5%， 质量浓度）于24孔板中，分别加入4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4, 4, 4-三氟乙酰乙 酸乙酯、4-氯苯甲酰乙酸乙酯、2-甲基苯甲酰乙酸乙酯，使用底物终浓度为500 mmol/L， 辅底物葡萄糖终浓度为750 mmol/L，NAD+的终浓度为为50 μmol/L，进一步混合均匀后， 于30°C、160 r/min的条件下进行还原转化反应I h，反应结束后用等体积乙酸乙酯萃取， 进一步在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A (Fe (ClO4)3溶液；0. 07 mol/L):显色剂B (HC104；0.1 mol/L) =20:800:800 (yL: yL: μ L)，在 20°C 下振荡反应 30 min，显色反应 液利用9倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510 nm波长下的紫外吸收值，与气相色谱法对 照。其结果如表1。
[0020] 实施例5:利用显色法测定CCZU-K14静息细胞还原4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)反 应进程 利用磷酸缓冲溶液（pH 7.0,100 mmol/L)配制CCZU-K14静息细胞悬浮液（5%，质量浓 度)于24孔板中，加入终浓度为500 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸乙酯（C0BE)、750 mmol/L 的葡萄糖和50以111〇1/1的嫩0+，混合均勾后在30<€、16〇17/1]1；[11的条件下进行还原转化反 应。反应不同的时间，分别取一定体积的反应液，并利用等体积乙酸乙酯溶液萃取。进一步 在24孔板中进行显色，萃取液：显色剂A (Fe2 (SO4)3溶液；0. 07 mol/L):显色剂B (H2SO4; 0.3mol/L)=20:800:800 (yL: yL: yL)，在 20°C 下振荡反应 30min，显色反应液利用 9 倍体积的无水乙醇混匀后，测其在510 nm波长下的紫外吸收值，其结果如图1所示。
[0021] 表1分析不同底物转化效果
【主权项】
1?重组还原酶菌株A cWi CCZU-K14,保藏号为CGMCC No. 9298。2. -种(6-羰基羧酸酯还原酶的的高通量筛选方法，其特征在于按照下述步骤进行： (1) 称取重组A cWi CCZU-K14静息细胞(湿重）悬浮于磷酸缓冲溶液体系（pH 7. 0， 100 mmol/L)形成10% (质量浓度）的细胞悬液，加入终浓度为500-3000 mmol/L的底物 0 -羰基羧酸酯、750-4500 mmol/L的葡萄糖和50 y mol/L的NAD+混合均匀后在30°C、160 r/min的条件下进行还原转化反应； (2) 反应结束，加入等体积乙酸乙酯萃取，显色是在24孔板中进行的； 萃取液：显色剂 A (0.04 ~ 0.08 mol/L):显色剂 B (0.1 ~ 0.3 mol/L) =20:800:800 (体积比)，在20~35 °C下显色反应15~30 min后取显色反应液至另一 24孔板中，加入9倍 体积的无水乙醇混合均匀，用紫外-可见分光光度计测其在510 nm波长下进行分析。3. 根据权利要求2所述的一种0 -羰基羧酸酯还原酶的的高通量筛选方法，其特征在 于显色剂 A 为 FeCl3、FeCl2、Fe2 (SO4) 3、FeS04、Fe (ClO4) 3、CoCl2S ZnCl 2中的一种。4. 根据权利要求2所述的一种0 -羰基羧酸酯还原酶的的高通量筛选方法，其特征在 于显色剂B为HCl或HClO4中的一种。5. 根据权利要求2所述的一种0 -羰基羧酸酯还原酶的的高通量筛选方法，其特征在 于显色剂B为H2SO4中的一种。
【专利摘要】本发明提供了一种β-羰基羧酸酯还原酶的筛选方法，属于生物技术领域。提供了一种利用β-羰基羧酸酯类化合物与金属离子显色液进行显色反应，并在24孔板中建立了β-羰基羧酸酯（例如，脂肪族和芳香族β-羰基羧酸酯）还原酶的高通量筛选方法。该方法具有操作简单、快速、准确和通量高等特点。CGMCC No.929820140613
【IPC分类】C12R1/19, C12Q1/26, C12N1/21
【公开号】CN105018399
【申请号】CN201410493856
【发明人】何玉财, 张丹平, 陶志成, 陆云, 杨振兴, 方月, 孔维国, 陈祎桐, 郭飞, 陈欣未
【申请人】常州大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年9月25日