一种抗凝血黑莓籽有效成分及其提取分离方法、应用
【专利说明】
[0001]
技术领域 本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种抗凝血黑莓籽有效成分及其提取分离方 法、应用。
【背景技术】
[0002] 黑莓jftz/wsspp. Blackberry为蔷薇科悬钩子属聚合果类植物，未作药用，是世界上新 兴的4种小果类果树之一。原产北美，其果实酸甜可口，具有很高的营养价值和药用价值， 除鲜食外还大部分制成速冻果、果汁、果酒和果酱等食品。文献检索发现对黑莓研究主要集 中在果实挥发油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓叶、种子中黄酮、花色苷及维生素￡含量分析 方面。
[0003] 黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工产品的副产物，含有约27. 14%的功能性油脂， 其中不饱和脂肪酸总量高达93. 55%，此外还有人体必需的氨基酸，在对抗动脉粥样硬化、抗 糖尿病、免疫调节、促进生长和智力发育等方面具有重要的作用。
[0004] 凝血的实质是呈水溶性的纤维蛋白原转变为水中不溶解的固态纤维蛋白的过程， 是在内源性或(和）外源性凝血途径下产生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下产生凝血 酶，最后在凝血酶的作用下使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途 径中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；APTT主要反映内源性凝血系统状况，与VIII、X、XI、 XII等内源性凝血因子活性有关；TT值是主要反映纤维蛋白原转变为纤维蛋白程度的重要 指标；FIB主要反映纤维蛋白原的含量。
[0005] 血栓形成是许多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深静脉血栓等的基本病理过程，它 严重地危害着人类的健康，它的形成与血小板的聚集、粘附、内源性和外源性凝血系统以及 纤维蛋白的形成密切相关。根据世界卫生组织的调查报告，由于动脉粥样硬化导致的血栓 疾病引起的死亡已经排到了第一位。动脉血栓是由于动脉粥样硬化，斑块不稳定发生了斑 块的破裂，使血液里的血小板发生聚集，激活了体内的凝血系统，最后导致血栓形成。一旦 堵塞以后就会发生组织的缺血和坏死，产生严重的后果。在动脉血栓性疾病的急性或特殊 状态下，需要辅助使用抗凝血药物，才能达到更好的抗血栓效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种抗凝血黑莓籽有效成分，同时提供一种抗凝血黑莓籽有效 成分的提取分离方法和应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种抗凝血黑莓籽有效成分的提取分离方法，包括以下步骤：1)以黑莓籽为原料，黑莓 籽破碎后，用石油醚浸提(浸提3-4次，每次3d)，石油醚浸提液合并挥干石油醚后，加入70 %乙醇浸提(浸提3次，每次3d)，乙醇浸提液合并、过滤、浓缩得乙醇总浸膏，依次用溶剂石 油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位； 2) 乙酸乙酯部位进行200~300目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，比例为 100:0~1:1，以TLC薄层色谱检测合并，得到6个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记 为组分1-6 (极性判断时所用体系为石油醚-乙酸乙酯)，其中组分5再经反复硅胶H柱色 谱、S印hadex LH-20柱色谱得到化合物1; 3) 正丁醇部位加入70 %乙醇溶解后，D-101大孔树脂吸附上样，静置过夜，后依次用 水、20 %乙醇、40 %乙醇、60 %乙醇、80 %乙醇和无水乙醇梯度洗脱，每种洗脱液洗脱5个 柱体积，每次2000 mL，回收洗脱液后，得到相应洗脱部分； 80%乙醇洗脱部分经硅胶H柱色谱，得到2个组分，按照所得组分极性由小到大依次标 记为组分1-2 (极性判断时所用体系为二氯甲烷-甲醇)，组分1经Sephadex LH-20凝胶 柱色谱，得到化合物2,组分2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱与反复硅胶H柱色谱，得到化 合物3; 60 %乙醇洗脱部分先进行200~300目硅胶柱色谱，后经硅胶H柱色谱，TLC薄层色谱 检测合并，得到2个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-2 (极性判断时所 用体系为二氯甲烷-甲醇)，组分1经反复硅胶H柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱，得 到化合物4;组分2经反复S印hadex LH-20凝胶柱色谱、硅胶H柱色谱，后所得样品经反相 液相制备色谱得到化合物5; 40 %乙醇洗脱部分先进行200~300目硅胶柱色谱，后经反复硅胶H柱色谱、S^hadex LH-20凝胶柱色谱，得到化合物6; 化合物1、2、3、4、5、6即为抗凝血黑莓籽有效成分。
[0008] 按照以上提取分离方法得到的抗凝血黑莓籽有效成分。
[0009] 抗凝血黑莓籽有效成分在制备抗凝血药物方面的应用。
[0010] 化合物1、2、3、4、5、6依次是1〇'，2〇'，3々，19〇'-四羟基-12-烯-28-乌苏酸（化 合物1)、委陵菜酸（化合物2)、9〇)_十八烯酸酰胺（化合物3)、甜叶苷Rl (化合物4)、 坡模酸-28-f P-D-吡喃葡萄糖酯（化合物5)、3, 5, 7, 2'，5' -五羟基黄烷（化合物6)，其 结构分别如下：
[0011] 本发明采用特殊的方法从黑莓籽的乙酸乙酯部位和正丁醇部位中分离得到6个 化合物，并对其体外抗凝血效果的考察，结果表明，化合物1~6均具有良好的抗凝血效果， 且化合物4~6的抗凝血效果比灯盏花素好，可见，它们可以单独或组合用于抗凝血剂。
【附图说明】
[0012] 图1为效果实验时的凝血机制图。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1 黑莓籽购于河南省封丘县黑莓种植基地，为蔷薇科悬钩子属植物黑莓沿/Ai/sspp. Blackberry 轩。
[0014] 本文中的乙醇浓度均为体积浓度。
[0015] 活性化合物的提取分离方法： (1) 黑莓籽破碎后，先用石油醚浸提4次，每次3 d，挥干石油醚后，加入70 %乙醇浸提 3次，每次3 d，浸提液合并、过滤、浓缩得乙醇总浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃 取，回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位； (2) 乙酸乙酯部位进行200~300目硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱（体积比例 100:0~1:1)，以TLC薄层色谱检测合并，得到6个组分，按照所得组分极性由小到大依次标 记为组分1-6 (极性判断时所用体系为石油醚-乙酸乙酯)，其中组分5再经反复硅胶H柱 色谱、S印hadex LH-20柱色谱等得到化合物1; (3) 正丁醇部位加入70 %乙醇溶解后，D-101大孔树脂吸附上样，静置过夜，后依次用 水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和无水乙醇梯度洗脱，每种洗脱液洗脱5个柱体 积，每次2000 mL，回收洗脱液后，得到相应洗脱部分； 80 %乙醇洗脱部分经硅胶H柱色谱，得到2个组分，按照所得组分极性由小到大依次标 记为组分1-2 (极性判断时所用体系为二氯甲烷-甲醇)，组分1经Sephadex LH-20凝胶 柱色谱，得到化合物2;组分2再经Sephadex LH-20凝胶柱色谱与反复硅胶H柱色谱，得到 化合物3; 60 %乙醇洗脱部分先进行200~300目硅胶柱色谱，后经硅胶H柱色谱，TLC薄层色谱 检测合并，得到2个组分，按照所得组分极性由小到大依次标记为组分1-2 (极性判断时所 用体系为二氯甲烷-甲醇)，组分1经反复硅胶H柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱，得 到化合物4;组分2经反复S印hadex LH-20凝胶柱色谱、硅胶H柱色谱，后所得样品进行吉 尔森制备液相得到化合物5; 40 %乙醇洗脱部分先进行200~300目硅胶柱色谱，后经反复硅胶H柱色谱、S^hadex LH-20凝胶柱色谱，得到化合物6。
[0016] 化合物 1、2、3、4、5、6依次是1〇'，2〇'，3々，19〇'-四羟基-12-烯-28-乌苏酸（1)、 委陵菜酸（2)、9〇)_十八烯酸酰胺（3)、甜叶苷Rl (4)、坡模酸-28-f P-D-吡喃葡萄糖 酯（5)、3, 5, 7, 2'，5' -五羟基黄烷（6)，运用多种谱学技术鉴定结构如下： 1 σ，2 σ，3々，19 σ-四羟基-12-烯-28-乌苏酸（1):白色粉末，C30H48O6, EI_MS?/z: 504 [Μ] +。1H-NMR (CD3OD, 400 MHZ) J: 0· 85 (3H，s，23-CH3)，0· 93 (3H，s，24-CH3)， 0.97 (3H, d,方4.0 HZ, 30-CH3), 1.02 (3H, s, 25-CH3), 1.06 (3H, s, 26-CH3), 1.24 (3H, s, 29-CH3), 1.40 (3H, s, 27-CH3). 13C-NMR (CD3OD, 100 MHZ) 73.6 (C-l), 80.7 (C-2), 81.3 (C-3), 39.0 (C-4), 55.0 (C-5), 17.8 (C-6), 34.2 (C-7), 44.4 (C-8), 49.6 (C-9), 38.9 (C-10), 27.1 (C-Il), 130.7 (C-12), 138.9 (C-13), 42.6 (C-14), 30.7 (C-15), 28.3 (C-16), 49.6 (C-17), 55.0 (C-18), 73.6 (C-19), 43.1 (C-20), 27.1 (C-21), 38.9 (C-22), 29.7 (C-23), 22.4 (C-24), 12.9 (C-25), 16.6 (C-26), 24.9 (C-27), 182.4 (C-28), 19.4 (C-29), 27.3 (C-30)。
[0017] 委陵菜酸（2):白色粉末，C30H48O5,EI-MSa/z: 488[M] +。1H-NMR (CD3OD, 400 MHZ) δ： 0.79 (3Η, s, CH3-29), 0.80 (3Η, s), 1.01 (3Η, s), 1.01 (3Η, s), 1.18 (3Η, s), 1.33 (3Η, s), 0.93 (3Η, d, J=^ HZ, Η-30), 2.92 (1Η, d, J=12 ΗΖ, Η-3σ), 3.62 (1Η, d, J=12 HZ, Η-2 ^ ), 2.5 (1Η, s, Η-18), 5.29 (1Η, s, Η-12). 13C-NMR (CD3OD, 100 MHZ) J: 48.1 (C-I)，69.6 (C-2), 84.6 (C-3), 41.2 (C-4), 56.8 (C-5), 19.8 (C-6)， 34.2 (C-7)， 40.6 (C-8)， 48.2 (C-9)， 39.3 (C-10)， 24.9 (C-Il)， 129.4 (C-12), 140.2 (C-13), 42.7 (C-14), 29.7 (C-15), 26.7 (C-16), 48.3 (C-17), 55.2 (C-18), 73.7 (C-19), 43.1 (C-20), 27.4 (C-21), 39.1 (C-22), 29.4 (C-23), 17.6 (C-24), 17.1 (C-25), 17.5 (C-26), 24.8 (C-27), 182.3 (C-28), 27.2 (C-29), 16.6 (C-30)〇
[0018] 9⑵-十八烯酸酰胺（3):白色粉末，C 1SH35N0, EI-MS餘281[Μ]+。 1H-NMR(O)Cl3-CD 3ODdOO MHZ) ^ ： 5. 30 (2Η, m, -CH=CH-), 2. 16 (2H, t, J=^ HZ, -COCH2), 1.98 (4H, m, 8，11-CH2), 1.57 (2H, t,方8HZ, 3-CH2), 1.27 (20H, s, 4 ~ 7, 12 ~17-CH2), 0· 85 (3H, t,方8 HZ, 18-CH3). 13C-NMR(CDC13-CD30D，400 MHZ) J: 179.11 (C-I)，36.5 (