] 实施例7 提取方法包括以下步骤： ① 药材预处理：将紫锥菊地上部分粉碎过60目筛；加入脱脂溶剂，脱脂后，将脱脂溶剂 于60°C条件下挥干，处理后的药材备用； ② 提取：称取①处理得到的药材l〇〇g，加入1500g水，调pH为3,预热至60°C后，加入 5g酶制剂，酶解时间60min，80°C灭酶10min，在80°C继续搅拌保温Ih; ③ 浓缩：离心，将上清液旋蒸减压浓缩至生药量1 :1的浓缩液； ④ 醇沉：向浓缩液中加入3倍的无水乙醇，4°C条件下静置24小时； ⑤ 洗涤：将④得到的醇沉液抽滤，得到的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤； ⑥ 干燥：将沉淀物用2倍量的水复溶，在150°C的条件下喷雾干燥得到紫锥菊多糖。
[0030] 其中，所述脱脂溶剂为石油醚、1，2-环氧丙烷、乙醚的混合，其质量份数比为： 1. 5:0. 07:0. 05。
[0031] 其中，酶制剂为1.36g纤维素酶、2. 95g果胶酶、0. 58g蜗牛酶、0. 14g植酸酶的混 合。
[0032] 一、得到的紫锥菊多糖的活性成分分析 多糖的处理过程： ①预处理：将多糖制成5mg/mL的溶液，用Sevage法除蛋白，用大孔树脂AB-8冷浸法脱 色ld〇
[0033] ②纯化：采用DEAE-Cellulose(DE-52)层析柱，以NaCl溶液梯度洗脱。
[0034] ③样品收集：以硫酸苯酚法检测各管多糖含量，依据洗脱曲线合并峰位，浓缩，透 析。
[0035] ④干燥：将透析液浓缩，冷冻干燥得到紫锥菊纯净组分。
[0036] I. 1材料与仪器 I.I. 1材料与试剂 实验所需的材料与试剂见表1-1。
[0037]表1-1实验材料与试剂
I. 1. 2仪器与设备 实验所需的仪器与设备见表1-2。
[0038] 表1-2实验仪器与设备
1.2实验方法 1. 2. 1多糖分子量测定 本部分采用高效液相色法测定各EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子量。色谱条件： 流动相：〇.lmol/LNaNOj^#液； 流速：1. 〇ml/min; 柱子：ShodexOHpak806 和 802 串联； 检测器：示差折光检测器（Optilabrex)和激光检测器（DAWNHELE0S-II)联用（美国 怀雅特公司）； 样品前处理：用流动相溶解稀释至5000ppm进样。
[0039]L2. 2XRD分析 将EPPSI、EPPSII、EPPSIII压于样品架上进行X射线多晶衍射测定。条件：陶瓷X光 管，Cu靶，额定电压40kV，额定电流50mA，扫描范围2 0 5-60。
[0040] 1. 2. 3红外分析 将KBr干燥后取适量与500yg纯化样品EPPSI、EPPSII、EPPSIII混合，在红外灯下 于玛瑙研钵中研磨均匀至无晶粒，用10X107压力在压油机上压5min，取压的薄片在红外 光谱仪与400-4000cm-l范围内扫描，记录光谱数据和光谱图。
[0041] 1.2.4核磁共振 称取多糖组分30mg分别溶于0. 5mLD2O中，进行IHNMR及13CNMR核磁分析。
[0042] 1. 3实验结果与分析
[0043]I. 3. 1多糖分子量测定
[0044]EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子量测定结果分别见图1、2、3。
[0045]由图 1至 3,可见EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子量分别为 21. 5KDa、12.OKDa、 13.OKDa。分子量的不同可能导致活性的差异，因此有必要进一步研究制得的EPPSI、EPPS II、EPPSIII的活性。
[0046]I. 3. 2XRD分析
[0047]EPPSI、EPPSII、EPPSIII的XRD分析结果见图 4。
[0048]由图4可见，EPPSI、EPPSII、EPPSIII在2 0为24左右有弱的衍射峰，几乎为 无定形区，说明它们结晶度低，均处于无定形状态。EPPSII的衍射峰强些，可能较EPPSI、 EPPSIII其结晶性好些。 1. 3. 3红外分析 EPPSI、EPPSII、EPPSIII的红外分析分别见图5、6、7。 由图5至7可知，EPPSI、EPPSII、EPPSIII的基团非常相似。图5中3371. 9cm-l为O-H的伸缩振动，说明分子中含羟基。2933. 27cm-l为C-H伸缩振动。1152. 76、 1080. 21、1026. 52cm-l三个峰为吡喃糖环特征吸收峰，是其糖苷键C-O-C的非对称振动 峰，在669. 51cm-l处为吡喃糖环C-O-C的对称振动峰。说明EPPSI为吡喃糖。图6中 3400. 72cm-l为O-H的伸缩振动，说明分子中含羟基。2936. 81cm-l为C-H伸缩振动。图6 中3431. 66cm-l为O-H的伸缩振动，说明分子中含羟基。2937. 81cm-l为C-H伸缩振动。 1. 3. 4核磁共振
[0049] 1. 4 小结 本部分实验通过简单的波谱分析得到以下结论：（1)EPPSI、EPPSII、EPPSIII的分子 量分别为 21. 5KDa、12. 0KDa、13. 0KDa。（2)EPPSI、EPPSII、EPPSIII的结晶度都很低， 均处于无定形状态。（3)红外表明EPPSI、EPPSII、EPPSIII的结构相似，EPPSI特征峰较 明显为吡喃糖。（4)EPPSI的核磁结果证明了EPPSI为吡喃糖，且发生C-l、C-6取代。
[0050] 二、制备得到的紫锥菊多糖的免疫活性研究 本实验以小鼠NK细胞和小鼠单核巨噬细胞RAW264. 7为对象，研究紫锥菊多糖的免疫 活性。
[0051] 2. 1实验材料 2. I. 1材料与试剂 实验所需的材料与试剂见表2-1。
[0052] 表2-1实验材料与试剂
2.I. 2仪器与设备 实验所需的仪器与设备见表2-2。
[0053] 表2-2实验仪器与设备
2. 2实验方法 2. 2. 1对NK细胞活性影响 NK细胞为自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，具有非特异性杀伤作用，在免疫系统 中发挥着重要的作用。不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与 超敏反应和自身免疫性疾病的发生。K562是白血病细胞，处于高度未分化阶段，从白血病 急变期的患者的胸水中分离建立的。K562是NK细胞的敏感高度敏感的体外靶标。检测NK 细胞的杀伤活性经常用它做靶细胞。
[0054]MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的 琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan)并沉积在细 胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm测 定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
[0055] 小鼠脾脏在体内IL-3诱导下可促进NK细胞的分化。本部分实验以从小鼠脾脏中 分离NK细胞为效应细胞，以K562细胞为靶细胞，采用MTT比色法检测细胞数确定NK细胞 对靶细胞K562的杀伤率。
[0056] 2. 2.I.1小鼠脾细胞悬液的制备 脱颈处死小鼠，75%酒精浸泡消毒2-3min，超净台内取脾脏，用PBS冲洗1次，然后于 150目筛网中研磨，边研磨边加入20%FBS的RPMI1640培养液，过筛至50mL离心管中。800 rpm，离心5min，弃上清，加入Tris-MMCl缓冲液5mL，吹打均勾，静置3-4min。1000rpm 离心5min，弃上清，用5mL含1%P/S的PBS洗2次，用5mlRPMI1640洗1次，台盼蓝染色、 计数，弃上清，用10%FBS、1%P/S的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度至5X106/mL，待用。
[0057] 2. 2. L 2靶细胞的制备 K562细胞置离心管中，1200rpm/min，离心 3min，用 10%FBS、1%P/S的RPMI1640完全 培养液调整成浓度为5XIO5Ail的细胞悬液。
[0058] 2. 2.I. 3NK细胞活性的测定 将小鼠脾细胞悬液加入96孔板中，每孔5〇1^，再依次加入含￡??54??3 14??3 11、EPPSIII50、100、250yg/ml的RPMI1640 完全培养液，各做 4 复孔。于 37 °C、5%C02培养箱 培养12h后，加入K562细胞悬液50y1，同时设设空白对照组、靶细胞对照组及效应细胞对 照组。再培养24h后弃上清，每孔加入0.5mg/mL的MTT50yL，继续培养4h后，每孔加 入DMS0150yL，培养Ih后，在微孔板快速振荡器上振摇5min，使蓝紫色甲瓒结晶充分溶 解，用酶标仪测定各孔在570nm处的吸光度值。结果以NK细胞杀伤率表示，NK细胞杀伤 率按公式（5-1)计算： NK细胞活性（％) = [1-(实验组OD57toni-效应细胞对照组OD57toni) /靶细胞对照组OD值]X100% (5-1) 2. 2. 2对RAW264. 7细胞活性影响 RAW264. 7是小鼠单核巨噬细胞是单核-巨噬细胞具有多方面的生物功能，主要可以 概括为以下几个方面：①非特异免疫防御。当外来病原体进入机体后，在激发免疫应答前就 可被单核-巨噬细胞吞噬清除，但少数病原体可在其胞内繁殖。②清除外来细胞。③非特 异免疫监视。④递呈抗原。即当外来抗原进入机体后，首先由单核一巨噬细胞吞噬、消化， 将有效的抗原决定簇和MHCII类分子结合成复合体，这种复合体被T细胞识别，从而激发免 疫应答。⑤分泌介质IL-1、干扰素、补体（CUC4、C2、C3、C、B因子）等。
[0059] 本部分实验以RAW264. 7为研究对象，通