针对组织因子途径抑制剂(tfpi)的优化的单克隆抗体的利记博彩app
【专利说明】针对组织因子途径抑制剂（TFPI)的优化的单克隆抗体
[0001] 本申请是申请日为2011年03月01日，申请号为201180022078. 8,发明名称为"针 对组织因子途径抑制剂（TFPI)的优化的单克隆抗体"的发明专利申请的分案申请。
[0002] ZhuozhiWang,JunliangPan,JoannaGrudzinska，ChristianVotsmeier,Jan TebbejJoergBirkenfeldjNinaWobstjSimoneBrlicknerjSusanneSteinig，PeterScholz
[0003] 序列表提交
[0004] 与本申请有关的序列表经由EFS网以电子形式提交，并且在此通过提及而将其完 整收入说明书中。 发明领域
[0005] 提供了结合人组织因子途径抑制剂（TFPI)的分离的单克隆抗体及其片段。
[0006] 发明背景
[0007] 血液凝固（bloodcoagulation)是血液形成稳定的凝块以使流血停止的过程 (process)。该过程牵涉血液中循环的许多酶原和辅因子原（或"凝固因子"）。那些酶原 和辅因子原经由序贯或同时将它们转化成活化形式的数种途径而相互作用。最后，所述过 程导致在存在因子Va、离子钙、和血小板的情况中由激活的因子X(FXa)将凝血酶原激活为 凝血酶。激活的凝血酶继而诱导血小板聚集，而且将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，其然后被 激活的因子XIII(FXIIIa)交联以形成凝块。
[0008] 可以通过两种独特的途径来实施导致因子X激活的过程：接触激活途径（以前称 为内源性途径）和组织因子途径（以前称为外源性途径）。先前认为，凝固级联由连接至共 同途径的同等重要的两种途径组成。现在知道用于启动血液凝固的主要途径是组织因子途 径。
[0009] 因子X可以被与激活的因子VII(FVIIa)联合的组织因子（TF)激活。因子Vila和 其必需的辅因子TF的复合物是凝固（clotting)级联的一种有力的引发剂（initiator)。
[0010] 凝固的组织因子途径受组织因子途径抑制剂（"TFPI"）负控制。TFPI是FVIIa/TF 复合物的一种天然的、FXa依赖性反馈抑制剂。它是多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的 成员。在生理学上，TFPI结合激活的因子X(FXa)以形成异二聚体复合物，其随后与FVIIa/ TF复合物相互作用以抑制其活性，如此关闭凝固的组织因子途径。原则上，阻断TFPI活性 可以恢复FXa和FVIIa/TF活性，如此延长组织因子途径作用的持续时间，而且放大FXa的 生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。
[0011] 实际上，一些初步实验证据已经指明，通过针对TFPI的抗体来阻断TFPI活 性使延长的凝固时间正常化或者缩短流血时间。例如，Nordfang等显示了血友病血浆 的延长的稀释凝血酶原时间（diluteprothrombintime)在用针对TFPI的抗体处理 血衆后正常化（Thromb.Haemost, 1991，66 (4) : 464-467)。类似地，Erhardtsen等显不 了通过抗TFPI抗体显著缩短血友病A兔模型中的流血时间（BloodCoagulationand Fibrinolysis, 1995, 6:388-394)。这些研究提示了抗TFPI抗体对TFPI的抑制对于治疗血 友病A或B可以是有用的。在这些研究中仅使用多克隆抗TFPI抗体。
[0012] 使用杂交瘤技术，制备并鉴定针对重组人TFPI(rhTFPI)的单克隆抗体。参见 Yang等，Chin.Med.J.，1998, 111(8) :718-721。测试了单克隆抗体对稀释凝血酶原时 间（PT)和激活部分促凝血酶原激酶时间（APTT)的影响。实验显示了抗TFPI单克隆抗 体缩短因子IX缺乏型血浆的稀释促凝血酶原激酶凝固时间。提示了组织因子途径不仅 在生理学凝固而且在血友病出血中发挥重要作用（Yang等，HunanYiKeDaXueXue Bao, 1997, 22(4) :297-300)。
[0013] 因而，需要对TFPI特异性的抗体来治疗血液学疾病和癌症。
[0014] 一般而言，已经使用遗传工程来创建鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗体 以生成用于人疾病的治疗性抗体。显示了鼠单克隆抗体作为治疗剂具有有限的用途， 这是由于短的血清半衰期、不能触发人效应器功能、和人抗小鼠抗体的生成（Brekke 和Sandlie,"TherapeuticAntibodiesforHumanDiseasesattheDawnofthe Twenty-firstCentury, "Nature2, 53, 52-62，（2003 年I月）。已经显不了嵌合抗体引起 人抗嵌合抗体应答。人源化抗体进一步使抗体的小鼠构件最小化。然而，完全人抗体完全 避免与鼠元件有关的免疫原性。如此，需要开发完全人抗体以避免与其它形式的遗传工程 化单克隆抗体有关的免疫原性。特别地，若使用具有鼠构件或鼠起源的抗体，则诸如用抗 TFPI单克隆抗体的血友病治疗会需要的长期（chronic)预防处理具有形成对该治疗的免 疫应答的高风险，这是由于需要的频繁剂量给药和长的疗法持续时间。例如，血友病A的抗 体疗法可以每周需要剂量给药，持续患者一生。这对免疫系统会是连续的考验。如此，需要 用于血友病和相关的遗传性和获得性凝固缺乏或缺陷的抗体疗法的完全人抗体。
[0015] 已经经由由Koehler和Milstein在"ContinuousCulturesofFusedCells SecretingAntibodyofPredefinedSpecificity,'Nature256,495-497(1975)中所描述 的杂交瘤技术来生成治疗性抗体。也可以在原核生物和真核生物中重组生成完全人抗体。 治疗性抗体优选抗体在宿主细胞中的重组生成而不是杂交瘤生成。重组生成具有如下的优 点，即较大的产物一致性、可能地较高的生产水平、和受控制的制备，其使动物衍生的蛋白 质的存在最小化或消除动物衍生的蛋白质的存在。出于这些原因，想要具有重组生成的单 克隆抗TFPI抗体。
[0016] 另外，因为TFPI以高亲和力结合活化的因子X(FXa)，所以有效的抗TFPI抗体应当 具有相当的亲和力。如此，期望具有可以与TFPI/FXa结合竞争的结合亲和力的抗TFPI抗 体。
[0017] 发明概述
[0018] 提供了针对人组织因子途径抑制剂（TFPI)的单克隆抗体。进一步提供了编码其 的分离的核酸分子。还提供了包含抗TFPI单克隆抗体的药物组合物和治疗遗传性和获得 性凝固缺乏或缺陷诸如血友病A和B的方法。还提供了用于缩短出血时间的方法，其通过 对有此需要的患者施用抗TFPI单克隆抗体进行。还提供了用于生成依照本发明的结合人 TFPI的单克隆抗体的方法。
[0019] 在一些实施方案中，已经优化提供的针对TFPI的单克隆抗体，例如以具有升高的 亲和力或升高的功能活性。
[0020] 本发明还涉及如下方面：
[0021] 1. -种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含含有 SEQIDN0:1中所显示的氨基酸序列的重链，其中所述氨基酸序列包含一个或多个氨基酸 修饰。
[0022] 2.项1的分离的单克隆抗体，其中所述修饰选自下组：取代、插入或缺失。
[0023] 3.项2的分离的单克隆抗体，其中所述修饰是取代。
[0024] 4.项3的分离的单克隆抗体，其中所述取代在选自下组的位置处：Ql，R30S31，G33 ，M34,S35,S50, 151，R52,S54,S55,S56,K99 和F104。
[0025] 5?项4的分离的单克隆抗体，其中所述取代选自下组：Q1E,R30S,S31P,S31V,G33A ,G33K,G33P,M34I,M34K,S35L,S35D,S50A,I51D,I51E,R52S,S54F,S54D,S55A,S55G,S55R,S 56G,K99V,K99L和F104Y。
[0026] 6.项1的分离的单克隆抗体，其中所述抗体选自下组：IgGl,IgG2,IgG3,IgG4,IgM ,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗体。
[0027] 7.项I的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含选自下组的两个或多个取 代：Q1E,R30S,S31P,S31V,G33A,G33K,G33P,M34I,M34K,S35L,S35D,S50A,I51D,I51E,R52S, S54F,S54D,S55A,S55G,S55R,S56G,K99V,K99L和F104Y。
[0028] 8.项7的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQIDNO: 1中显示的氨 基酸序列，其中所述序列包含选自下组的下列取代：
[0074] 9.-种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含含有 SEQIDN0:2中显示的氨基酸序列的轻链，其中所述氨基酸序列包含一个或多个氨基酸修 饰。
[0075] 10.项9的分离的单克隆抗体，其中所述修饰选自下组：取代、插入或缺失。
[0076] 11.项10的分离的单克隆抗体，其中所述修饰是取代。
[0077] 12.项11的分离的单克隆抗体，其中所述取代在选自下组的位置处：D1，12,A13， S21,N26,R28,N29,A32,H33,Y48,Y49,N51,N52,P54,G56,E80,S89,D91,D92,G93,V94,P95 和 V96〇
[0078] 13.项12的分离的单克隆抗体，其中所述取代选自下组：D1S,I2Y，A13S,S21T，N26 A,R28P,N29K,A32N,H33Y,Y48F,Y49R,N51S,N51V,N52G,P54L,G56D,E80M,S89A,D91L,D91R, D91W,D91K,D92S,D92T,G93S,V94T,P95V,P95A,V96G,V96M和V96W。
[0079] 14?项9的分离的单克隆抗体，其中所述抗体选自下组：IgGl,IgG2,IgG3,IgG4,Ig M,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗体。
[0080] 15.项9的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含选自下组的两个或多个 取代：D1S,I2Y,A13S,S21T,N26A,R28P,N29K,A32N,H33Y,Y48F,Y49R,N51S,N51V,N52G,P54L ,G56D,E80M,S89A,D91L,D91R,D91W,D91K,D92S,D92T,G93S,V94T,P95V,P95A,V96G,V96M和 V96ff〇
[0081] 16.项15的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQIDNO:2中显示的 氨基酸序列，其中所述序列包含选自下组的下列取代：
[0124] 17. -种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
[0125] (a)包含SEQIDNO: 1中显示的氨基酸序列的重链，其中所述重链氨基酸序列包含 一个或多个氨基酸修饰；和
[0126] (b)包含SEQIDNO: 2中显示的氨基酸序列的轻链，其中所述轻链氨基酸序列包含 一个或多个氨基酸修饰。
[0127] 18.项17的分离的单克隆抗体，其中所述重链修饰是取代。
[0128] 19.项18的分离的单克隆抗体，其中所述重链取代包含选自下组的取代：Q1E，R30 S,S31P,S31V,G33A,G33K,G33P,M34I,M34K,S35L,S35D,S50A,I51D,I51E,R52S,S54F,S54D, S55A,S55G,S55R,S56G,K99V,K99L和F104Y。
[0129] 20.项17的分离的单克隆抗体，其中所述重链包含两个或多个取代。
[0130] 21.项20的分离的单克隆抗体，其中所述重链包含选自下组的取代：
[0176] 22.项17的分离的单克隆抗体，其中所述轻链修饰是取代。
[0177] 23.项22的分离的单克隆抗体，其中所述轻链取代包含选自下组的取代：D1S，I2Y ,A13S,S21T,N26A,R28P,N29K,A32N,H33Y,Y48F,Y49R,N51S,N51V,N52G,P54L,G56D,E80M,S 89A,D91L,D91R,D91W,D91K,D92S,D92T,G93S,V94T,P95V,P95A,V96G,V96M和V96W。
[0178] 24.项17的分离的单克隆抗体，其中所述轻链包含两个或多个取代。
[0179] 25.项24的分离的单克隆抗体，其中所述轻链包含选自下组的取代：
[0222] 26.项17的分离的单克隆抗体，其中所述抗体选自下组：IgGl，IgG2,IgG3,IgG4,I gM,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗体。
[0223] 27. -种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ IDNO:3中显示的且包含一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
[0224] 28.项27的分离的单克隆抗体，其中所述修饰选自下组：取代、插入或缺失。
[0225] 29.项28的分离的单克隆抗体，其中所述修饰是取代。
[0226] 30.项29的分离的单克隆抗体，其中所述取代在选自下组的位置处：Ql，S30,N32， S37,G44, 153,K55,S57,K58,N61，D62,H103,H107,G109 和Y112。
[0227] 31.项30的分离的单克隆抗体，其中所述取代选自下组：Q1E，S30R，N32D，N32E，S3 3G,S37N,G44S,I53T,K55Y,S57K,S57R,K58M,N61G,N61T,D62I,D62R,D62Q,D62L,D62S,D62V ,D62N,D62K,H103D,H103G,H107M,G109A和Y112D。
[0228] 32.项27的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含选自下组的两个或多个 取代：Q1E,S30R,N32D,N32E,S33G,S37N,G44S,I53T,K55Y,S57K,S57R,K58M,N61G,N61T,D62 I,D62R,D62Q,D62L,D62S,D62V,D62N,D62K,H103D,H103G,H107M,G109A和Y112D。
[0229] 33.项32的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQIDNO:3中显示的 氨基酸序列，其中所述序列包含选自下组的下列取代：
[0256] 34?项27的分离的单克隆抗体，其中所述抗体选自下组：IgGl，IgG2,IgG3,IgG4,I gM,IgAl,IgA2,分泌性IgA,IgD和IgE抗体。
[0257] 35. -种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ IDNO:4中显示的且包含一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。
[0258] 36.项35的分离的单克隆抗体，其中所述修饰选自下组：取代、插入或缺失。
[0259] 37.项36的分离的单克隆抗体，其中所述修饰是取代。
[0260] 38.项37的分离的单克隆抗体，其中所述取代在选自下组的位置处：M4,V30,F31， S32,D33,N35,T36,Y37,N39,L42,K44,Q50,L51,Y54,K55,G56,S57,A60,S61,D97 和S98。
[0261] 39.项38的分离的单克隆抗体，其中所述取代选自下组：M4I，M4L，V30L，F31I，F31 M,F31Y,F31H,S32L,S32R,S32Y,D33F,D33R,N35I,N35L,N35T,N35V,T36N,Y37F,N39D,L42Q, K44R,Q50R,L51R,Y54F,K55L,G56D,G56A,G56V,S57Y,A60D,S61C,D97M,D97T和S98H。
[0262] 40.项35的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含选自下组的两个或多 个取代：M4I,M4L,V30L,F31I,F31M,F31Y,F31H,S32L,S32R,S32Y,D33F,D33R,N35I,N35L ,N35T,N35V,T36N,Y37F,N39D,L42Q,K44R,Q50R,L51R,Y54F,K55L,G56D,G56A,G56V,S57Y ,A60D,S61C,D97M,D97T和S98H。
[0263] 41.项40的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQIDNO:4中显示的 氨基酸序列，其中所述序列包含选自下组的下列取代：
[0326] (kkk)V30L+S32R+N35I+T36N ；
[0327] (111)N35V+G56D ；
[0328] (_n)N35L+G56A ;和
[0329] (nnn)D33F+Y54F〇
[0330] 42?项35的分离的单克隆抗体，其中所述抗体选自下组：IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, I gM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗体。
[0331] 43. -种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
[0332] (a)包含SEQ ID NO: 3中显示的氨基酸序列的重链，其中所述重链氨基酸序列包含 一个或多个氨基酸修饰；和
[0333] (b)包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的轻链，其中所述轻链氨基酸序列包含 一个或多个氨基酸修饰。
[0334] 44.项43的分离的单克隆抗体，其中所述重链修饰是取代。
[0335] 45.项44的分离的单克隆