(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的生物合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种（似-4-氯-3-哲基了酸己醋及其衍生物的的生物合成方法，属 于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] (々-4-氯-3-哲基了酸醋（CHBE)是一种重要的手性搁块，可用于合成（々-丫-氨 基-0-了酸a-肉碱和（一)-大内酷亚胺，还可转化生成（+)-负霉素和手性2,5-环己二 締酬的合成子。制备光学活性手性CHBE的方法可分为化学催化加氨法和生物催化法。其 中，化学催化加氨法是W4-氯己酷己酸己醋（C0邸）为反应前体，W稀有金属锭的络合物为 催化剂，进行不对称催化加氨制备对映体纯CHBE，此方法的优点是适合规模化生产，但是其 具有催化剂价格昂贵、环境不友好和产物光学纯度不理想等缺点，并且在催化过程中需高 压，因此对设备要求也较高。而生物催化法具有高活性、高立体选择性、反应条件温和及社 会效益好等优点。因此，利用生物催化剂制备光学活性CHBE备受研究者的青睐。
[0003] 生物催化不对称还原C0BE主要是在脱氨酶或幾基还原酶的催化作用下进行，同 时还需还原态辅酶NADH或NADPH的参与。然而，辅酶NADH或NADPH价格昂贵，因此限制了 其应用。而利用全细胞内的辅酶循环系统，可经济地实现辅酶NADH或NADPH再生和循环 (WangL.J.，etal.Bioresour.Technol. 2011，102，7023-7028)。然而目前一般文献 中报道的幾基还原酶（々-CHBE(e.e. >99%)，其催化的底物CO邸浓度较低，而且通常需要在 反应过程中进行分批补料，或添加昂贵的NADH或者NADPH，从而才能达到一个令人较为满 意的底物浓度。并且大部分文献报道的都是有关于（句-4-氯-3-哲基了酸醋[(句-CHBE] 的生物合成。因此，寻找一种高活性及选择性的还原C0BE菌株合成（々-CHBE成为当务之 急。
[0004] 本研究组利用基因组挖掘技术构建了重组还原酶菌株大肠埃希氏菌 co7i。利用其全细胞催化剂，W葡萄糖为辅底物，加入低成本的NAD+，可实现辅酶再生，并实 现了（々-CHBE(6. 6. >99%)及其衍生物的高效合成，其反应过程中不需进行分批补料，且在 2L的反应体系中，底物浓度能够达到800-6000ml，（々-CHBE产率可高达99.0%。因此具 有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明需要解决的技术问题是公开一种本发明公开了一种（似-4-氯-3-哲基了 酸己醋及其衍生物的的生物合成方法，W克服现有技术存在的上述缺陷。
[0006] 本发明所述的大肠埃希氏菌C(97i，该菌株已于2014年11月13日保 藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、中屯、（CGMCC)，保藏号为CGMCCNo. 9955。
[0007] 上述大肠埃希氏菌公scAericAiaC(97i，CGMCCNo. 9955,用于（似-4-氯-3-哲基 了酸己醋及其衍生物的生物合成方法，按照下述步骤进行： 一、菌株的培养： (1) 种子液的摇瓶培养；将所说的大肠埃希氏菌&cAericAiaco7i，采用本领域常规的 方法，在种子液培养基中进行扩增培养，在25~37 °C和pH6. 0~8. 0条件下120~180巧m的 摇床上培养12~18h; (2) 发酵罐扩大培养：在5L发酵罐中加入50%-67% (体积比）的发酵培养基，接种量 占发酵培养基体积的2%~8%，接种至5L发酵罐中，通气量1:0. 1~1:1 (v/v/m)，揽拌转速 300~400iDm，温度25~37。C，pH6. 0~8. 0。细胞光密度00日。。=0. 60时，加入诱导剂IPTG(异 丙基硫代半乳糖巧）。培养12~24h后，离屯、、洗漆得到静息细胞。
[0008] 二、静息细胞催化4-氯己酷己酸己醋（C0邸）及其衍生物： 将收获的静息细胞，W10~100g湿重/L悬浮于抑为6. 0~7. 0的磯酸缓冲溶液-己酸 了醋（1: 1，体积比）中，加入4-氯己酷己酸己醋（C0邸）或其衍生物，使其浓度为800~6000 ml。在反应体系中，葡萄糖添加量为n(葡萄糖）；n(底物）=l:l(mol:mol)，NAD+添加量为 n(NA护）；n(底物）=0.05:l(mmol:mol)，在25~35。C、pH6.0~7.0和180巧m条件下反 应1~48h后，离屯、除去细胞，分析产物浓度； 其中步骤一（1)中所述的种子液培养基组成为葡萄糖5~15g/L，蛋白腺5~20g/L，酵 母膏 5~10g/L，NaCl0. 1~2. 0g/L，M拆〇40. 1~2. 0g/L，pH6. 0~8. 0 ; 其中步骤一（2)中所述的发酵培养基组成为葡萄糖5~15g/L，蛋白腺5~20g/L，酵母 膏 5~10g/L，NaCl0. 1~2. 0g/L，M拆〇40. 1~2. 0g/L，pH6. 0~8. 0 ; 其中步骤二所用的底物4-氯己酷己酸己醋（C0BE)的衍生物为2-漠苯己酬、4, 4, 4-S氣己酷己酸己醋、间硝基苯己酬、对氯苯己酬、2-氯苯基己酬、2-了酬、丙酬、己酷己酸己 醋、2-氧代-4-苯基了酸己醋。
[0009] 其中步骤二或利用Z-谷氨酷胺3% (质量比）和木糖4% (质量比）代替歴护。
[0010] 或者在磯酸缓冲溶液-己酸了醋（1:1，体积比）中添加0-环糊精为n(e-环糊 精）；n(底物）=〇:1~〇. 08:1 (mol:mol). 本发明的优点；本发明利用重组还原酶菌株大肠埃希氏菌co7i生物催 化剂实现（似-4-氯-3-哲基了酸己醋（e.e. >99%)及其衍生物的高效还原，无需添加额外 的NADH或NADPH，反应过程中不需进行分批补料，可实现高底物浓度C0BE的高效还原。该 技术路线具有工艺路线简单、反应条件温和及转化率高等优点。
【附图说明】
[0011] 图1为蛋白电泳图。
[0012]
【具体实施方式】
[0013] 本发明所设及的重组还原酶菌株大肠埃希氏菌C(97i，是本发明的 发明人利用基因组挖掘技术构建的还原酶菌株。从成出〇仿?扣Ssay皿wic(97arCGMCC 2. 1482 提取总DNA，根据成ori出(9如say皿?/?ic(97arNADPH-dependentaldehyde reductasegene(GenBank:U26463. 1)设计两段引物分别为含Ay过和公a曲创结合位点。 PCR增产物（5UL)用1%琼脂糖凝胶电泳检测达到要求后，对PCR扩增产物的纯化、与 pET-28a连接、质粒的提取均按照产品使用说明书进行，连接产物转化公.co"BL21值E3) 感受态细胞。经过筛选，获得一株高活性及立体选择性的重组还原酶菌株大肠埃希氏菌 co7i，其细胞破碎液的粗蛋白的电泳图如图1所示，目标酶蛋白为33. 4KD。重 组还原酶菌株大肠埃希氏菌co7i可催化C0邸和合成（々-CHBE( >99% 6. 6.)， 而重组菌株大肠埃希氏菌C(97i还原酶依赖于NADH，不依赖NADPH。该菌株已 于2014年11月13日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科 学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、中屯、（CGMCC)，保藏号 为CGMCCNo. 9955。
[0014] 本发明设及的大肠埃希氏菌C(97i具有如下微生物学特征； 1.形态特征： 杆状，周生鞭毛，能运动，无芽抱，大小为0. 5X1~3ym。
[0015] 2.平板固体培养基上的菌落特征（30 °C，24h): 圆形，1. 0~4. 0mm;培养初期表面有光泽、湿润、光滑。
[0016] 3.生长环境 最适生长温度37 °C，最适生长抑7.0。生长温度范围为15~45 °C。
[0017] 本发明中对CO肥及其衍生物、（々-CHBE及其衍生物的含量用手性气相色谱或者 手性液相色谱进行分析。
[0018] 在水相中底物C0BE浓度=C0BE的摩尔浓度/反应总体积 在水-己酸了醋两相中底物C0邸浓度=C0邸的摩尔浓度/有机相体积 实施例1 大肠埃希氏菌C07在种子液培养基(葡萄糖5 g/L蛋白腺5 g/L酵母膏5 g/L，化C1 0. 1 g/L，M拆〇40. 1 g/L，pH 6. 0)中进行扩增培养，在25 °C、120巧m的摇床上 培养18 h。进一步，在5 L发酵罐中加入加入占体积50%的发酵培养基(葡萄糖5 g/l，蛋白 腺5 g/L，酵母膏5 g/L，化C1 0. 1 g/L，M拆〇40. 1 g/L，pH 6.0)，接种量占发酵培养基体积 的8%。发酵罐操作条件为；通气量1:0. l(v/v/m)，揽拌转速300巧m，温度25。C，pH 6.0。 细胞光密度〇Dew=〇. 60时，加入诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖巧）。发酵24 h后，离屯、、 洗漆得到静息细胞。将收获的静息细胞，100g(湿重)细胞重新悬浮于抑为7. 0的2L磯 酸钟缓冲溶液己酸了醋（1:1，体积比）中，加入4-氯己酷己酸己醋（C0邸），使其终浓度分别 为800ml、1600ml和3000ml。在反应体系中，葡萄糖添加量为n(葡萄糖）；n(COB巧=1:1 (mol:mol)，NA护添加量为n(NAD+) ;n(C0邸）=0.05:1 (mmol:mol)。在25。C、抑 7. 0 和 180巧m条件下反应。反应8