含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微量物质检测技术领域，尤其涉及一种含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]抗生素是一种由微生物自身产生或人工合成、低浓度下能抑制微生物生产或杀灭其他微生物的有机化学物质，除了用于人类和动物细菌性感染疾病的治疗，抗生素也被作为促长剂和饲料添加剂在集约化畜牧业和养殖业中大量应用，随着大量抗生素的使用，越来越多不能被充分吸收利用的抗生素通过人畜粪便直接排出，这些含抗生素的粪便可通过有机肥料的施用进入农田与植物之间发生迀移，此外这些抗生素有可能通过渗透、径流、淋溶等方式迀移到地表水和地下水中，重新流入环境。
[0003]目前监测抗生素残留检测方法主要有微生物法、免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。微生物法简单快速，但检测限高，特异性差；色谱检测法耗时长、在残留分离检测中，样品前处理过程复杂，并影响分析的准确度；免疫检测法简单、快速，检出限低，可进行大规模筛选，但是其相应抗体的制备需要大量实验动物，而且抗体在恶劣环境下易于失活，影响检测结果。
[0004]此外也有采用分子印迹技术萃取抗生素，然后联用色谱质谱技术进行检测，比如用分子印迹固相萃取蜂蜜中的链霉素，亲水相互作用液相色谱-串联质谱分析检测链霉素，此分子印迹方法采用沉淀聚合法合成分子印迹聚合物，需在有机相中合成，反应时间过长，而且合成的聚合物成块状，需要经过长时间的打磨、筛分才能用于固相萃取，分子印迹聚合物利用率不高，此外还需联用色谱-质谱串联技术，所需仪器贵重。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物及其制备方法与检测应用，旨在解决现有含氨基抗生素检测技术易于失活、检测结果不佳等问题。
[0006]本发明是这样实现的，一种含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0007](I)固相载体玻璃珠上引入抗生素
[0008]将250?300g玻璃珠加入到120?160mL、I?4mol/L的NaOH水溶液中，加热沸腾10?15min，取出玻璃珠用水洗至洗液的pH = 8?9，烘干得到羟基化玻璃珠；
[0009]将羟基化玻璃珠加入到150mL干甲苯中，再加入3.3mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺，剧烈摇动后，室温下放置过夜，过滤、丙酮冲洗，得到硅烷化玻璃珠；
[0010]将10g硅烷化玻璃珠加入到50mL、pH7.4的PBS中，再加入3.5mL戊二醛，室温下反应2?3h，抽滤，水洗，收集半成品玻璃珠；
[0011]将50mL、pH 7.4的PBS以及25mg含氨基抗生素与半成品玻璃珠混合，剧烈摇动后，室温下放置过夜，过滤、水洗，得到含氨基抗生素衍生的玻璃珠。
[0012](2)合成抗生素印迹的纳米印迹聚合物
[0013]将Immol N，N’- 二亚甲基双丙烯酰胺、25?30mmol N-异丙基丙烯酰胺、18?20mmol N-叔丁基丙烯酰胺和0.0025?0.003mmol丙烯酸按混合并溶于10mL超纯水中，通氮气20?30分钟，将混合物倒入所述含氨基抗生素衍生的玻璃珠中，然后加入40?60mg过二硫酸铵和13?26 μ L四甲基乙二胺的水溶液，剧烈摇动后，室温下反应I?1.5h，反应混合物倒入至固相萃取管中，用6?8床的室温水洗涤玻璃珠，再用80?100mL、60?70热。C水淋洗，自然冷却至室温，用微孔超离心过滤装置离心分离得到含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物溶液。
[0014]本发明进一步提供了上述含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物在检测含氨基抗生素方面的应用。
[0015]优选地，所述含氨基抗生素的检测包括以下步骤:
[0016](I)酶标物辣根过氧化物酶-模板分子HRP-T的合成
[0017]将5?1mg辣根过氧化物酶溶于0.7?1.0mL, pH6.0的MES缓冲液中，再加入
0.2?0.4mgEDC和0.3?0.6mg NHS，室温下反应15min，用微孔超离心过滤装置3500rpm转速下分离除去缓冲液，用3?5mL、pH 7.40的PBS洗涤，收集活化后的辣根过氧化物酶，立即与1mL含8?1mg氨基抗生素的PBS液孵化2?3h，然后用4.0?5.0mL PBS缓冲液洗去未联接的抗生素，用微孔超离心过滤装置在转速3500rpm下分离得到酶标物HRP-T溶液；
[0018](2)标准曲线图制作
[0019]通过酶联免疫竞争吸附法测定不同浓度含氨基抗生素的吸光度，建立抗生素浓度-吸光度的标准曲线图；
[0020](3)含氨基抗生素的检测
[0021]将预处理后的待检测物通过酶联免疫竞争吸附法测定含氨基抗生素的吸光度，根据该吸光度与标准曲线图比对，获取待检测物中含氨基抗生素的类型和浓度；
[0022]在步骤(2)和(3)中，所述酶联免疫竞争吸附法具体为:将40 μ L、浓度为0.04?
0.06mg/ml的权利要求书I所述含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物溶液包被在96孔酶标板中；在室温下挥发至干，用PBS溶液洗涤，加入含有200?300 μ L含质量浓度为I %的表面活性剂Tween 20和质量浓度为0.1 %的牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，孵化Ih，用PBS溶液洗涤，然后每个孔中加入60?100 μ L的酶标物HRP-T溶液和含氨基抗生素标准溶液室温下孵化Ih，用含有质量浓度为I %的Tween 20和质量浓度为0.1 %的BSA的PBS溶液洗涤，加入60?100 μ LTMB试剂反应2?1min,加入0.5mol/L、60 -1OOyL H2SO4溶液终止反应；酶标仪读取器读取450nm处每个微孔溶液的吸光度。
[0023]4、如权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤(2)之前，还包括酶联免疫竞争吸附法的条件优化步骤，所述酶联免疫竞争吸附法的条件优化步骤具体过程为:
[0024]包被:取30?50 μ L、浓度为0.04?0.06mg/ml权利书要求书I中所述氨基抗生素印迹的纳米聚合物溶液至96孔酶标板中；在室温下挥发至干，用PBS溶液洗涤；
[0025]封闭:加入含有300 μ L含表面活性剂Tween 20质量浓度为0.5?3%和牛血清白蛋白BSA质量浓度为0.05?0.3%的PBS溶液，孵化I?2h ;然后再用300 μ L PBS溶液洗涤3次；
[0026]加样:加入100 μ L酶标物HRP-T溶液，孵化2h ；
[0027]显色与测定:用含有质量浓度为0.5?3%的Tween 20和质量浓度为0.05?
0.3%的BSA的PBS溶液洗涤，甩干，加入100 μ LHRP底物3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)试剂，孵化1min后，加入0.5mol/L H2SO410 μ L溶液终止显色反应，然后用酶标仪测定其在450nm处的吸光度，确定最优检测参数。
[0028]5、如权利要求4所述的应用，其特征在于，在步骤(3)中，所述待检测物为肉类，所述肉类包括鱼类、鸡肉；该肉类的预处理包括:鱼类样品去鳞、去皮，沿背脊取肌肉；鸡肉类样品去皮去骨，取肌肉部分。样品均质处理成肉糜状的待测试样。准确称取试样，置于聚苯乙稀离心管中，加入酸化乙腈，均质处理，漩祸混合，超声波提取，以4000r/min离心5?1min,上清液转移至蒸发瓶中；减压蒸发溶剂，用PBS缓冲液复溶，得到含氨基抗生素的PBS缓冲液。
[0029]优选地，在步骤(3)中，所述待检测物为牛奶，所述牛奶的预处理为:取牛奶进行离心分离，收集上层清液，上清液转移至蒸发瓶中；减压蒸发溶剂，用PBS缓冲液复溶，得到含氨基抗生素的PBS缓冲液。
[0030]优选地，在步骤(3)中，所述待检测物为水，所述水的预处理为:0.45um滤膜除去悬浮物，收集上层清液，上清液转移至蒸发瓶中；减压蒸发溶剂，用PBS缓冲液复溶，得到含氨基抗生素的PBS缓冲液。
[0031]优选地，所述含氨基抗生素包括链霉素、庆大霉素以及新诺明。
[0032]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明所采用的固相法合成抗生素印迹的纳米分子印迹聚合物可直接代替抗体，用仿生酶联免疫吸附法测定水中和食物(牛奶，鸡肉、猪肉、鱼肉、鸡蛋等)中的磺胺类、氨基糖苷类、头孢菌素等含有氨基的抗生素，不仅可以避免以上方法的缺陷，而且此方法样品的前处理简单，不需要进行分离，简单快速、检测特异性高，检出限低，此外，含氨基类抗生素印迹的纳米聚合物作为仿生抗体，一个月内其检测效果不变。
【具体实施方式】
[0033]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034]实施例1含氨基抗生素纳米分子印迹聚合物溶液的制备
[0035](I)固相载体玻璃珠上引入抗生素
[0036]将250g玻璃珠加入到120mL、lmol/L的NaOH水溶液中，加热沸腾15min，取出玻璃珠用水洗至洗液的PH = 8，烘干得到羟基化玻璃珠；
[0037]将羟基化玻璃珠加入到150mL干甲苯中，再加入3.3mL N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺，剧烈摇动后，室温下