基因lpl检测巴马香猪脂肪沉积的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪脂肪沉积检测领域，尤其是涉及一种基因 LPL检测巴马香猪脂肪沉 积的方法。
【背景技术】
[0002] 通过近几年深入研宄，人们逐渐认识到脂肪组织不仅仅是一个储存脂质的能量代 谢场所，还具有重要的分泌功能，它能够分泌多种生理活性因子，如瘦素（L印tin)、抵抗素、 脂联素（Adiponectin)、肿瘤坏死因子（Tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞 介素 6(Interleukin-6, IL-6)、诱导细胞死亡的DFF45样效应因子C(Cidec)和脂蛋白脂 酶（Lipoprotein lipase，LPL)。这些脂肪细胞分泌因子通过自分泌或旁分泌作用，与分布 于器官和组织中的相应受体结合，影响和调节脂肪组织或其他组织乃至整个动物机体的代 谢，对肥胖、糖尿病以及心血管疾病等代谢疾病都有影响。其中，脂蛋白脂酶（LPL)能够将 血液中乳糜微粒与极低密度脂蛋白所携带的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸向有关组织提 供合成甘油三酯所需的原料；LPL基因主要在脂肪组织、骨骼肌、心肌和乳腺中表达。过去 的研宄发现，动物的LPL缺失或活性不足会引起机体产生严重的脂肪代谢障碍，例如会导 致尚脂蛋白血症或引起脂蛋白代谢失调。
[0003] 动物组织沉积脂肪的能力主要取决于两个方面，一个是组织中脂肪的合成与分解 速率，另一个是甘油三酯和脂肪酸的转运速度。在脂质代谢中参与合成和分解代谢的脂质， 均须经过血液中的乳糜微粒（CM)和极低密度脂蛋白（VLDL)等多种脂蛋白的携带完成转 运。被转运的甘油三酯到达脂肪和肌肉组织后需由一系列酶及辅助因子的参与分解并释放 出脂肪酸，以在脂肪组织和肌肉的脂肪细胞中合成脂肪贮存或氧化供能。在这一过程中， LPL起着至关重要的调控作用。LPL通常以同源二聚体的形式发挥甘油三酯水解酶的功能， 并作为配体或桥接因子参与受体介导的脂蛋白摄入活动。除此之外，皮下脂肪组织中LPL 的高表达能够显著地增加其脂肪的沉积。
[0004] 广西巴马香猪产于广西巴马瑶族自治县，该猪种具有体型矮小、皮薄多肉，并且遗 传稳定等珍奇特点。其肉味鲜美甘香，历来拥有山珍果子狸之美称，深受消费者喜爱，是猪 肉中的上品。巴马香猪作为优良的地方猪种，被列入国家级地方品种遗传资源保护名录，同 时也是国家小型猪基因库的成员之一。广西巴马香猪与长白猪、三元杂等瘦肉型猪种相比， 虽然体型矮小、生长周期长，但其肌内脂肪含量高，瘦肉率低，因而风味更佳。但过多的脂肪 沉积不仅会诱发畜禽疾病，还会降低畜产品的价值。因此，在生长过程中及时、动态地监测 其机体脂肪的沉积状况，从而防止脂肪的过度沉积，对于巴马香猪的养殖和生产具有很重 要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种快速准确、操作方便且不影响猪正常生长的 基因 LPL检测巴马香猪脂肪沉积的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：基因 LPL检测巴马香猪脂肪沉 积的方法，利用基因 LPL在脂肪组织中的表达水平来检测猪脂肪沉积。
[0007] 上述基因 LPL检测巴马香猪脂肪沉积的方法，通过定量PCR来检测基因 LPL在脂 肪组织里mRNA的表达量，用于定量PCR基因 LPL特异片段的引物对分别具有以下碱基序 列：
[0008] Forward primer (Pl) ：TGCTGGGAATCCAAACTGAA ；
[0009] Reverse primer(P2) ：TCTGGCACCACTGGAACAAT〇
[0010] 上述基因 LPL检测巴马香猪脂肪沉积的方法，包括以下步骤：
[0011] (1)从被检测的猪组织中抽提总RNA，反转录得到相应的cDNA样品；
[0012] (2)用引物对Forward primer和Reverse primer对步骤（1)中的cDNA样品进行 定量PCR。
[0013] 步骤（1)中的反转录反应体系和条件为：在20 μ 1反转录体系中，加入4 μ 1总 RNA，2yl 01ig(dT)，4yl DEPC水，先置于70°C温育lOmin，再置于冰上急速冷却2min ;然 后加入：1 μ I dNTP Mix (Solarbio)，0.5yl Reverse Transcriptase M-MLV (TaKaRa)，4 μL Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 5 X (TaKaRa)，0.5y I RRI (TaKaRa)，4 μ I DEPC 水， 依次置于 42°C lh，90°C 10min，20°C 2min ;最后-20°C保存。
[0014] 步骤（2)中定量PCR扩增步骤的反应体系和反应条件为：
[0015] 反应体系：在20 μ 1定量PCR反应体系中，含有1 μ I cDNA模板，10 μ SYBR Premix Ex Ta 定量 II 2Χ (TaKaRa SYBI^1Premix Ex Ta 定量 tmII (Tli RNaseH Plus)试剂盒）， 0·4μ1 ROX Reference DyeII 50X (TaKaRa SYBR? Premix Ex Ta 定量 ?II(Tli RNaseH Plus)试剂盒），1μΜ 的 ΙμL 引物 Forward primer，ΙμΜ 的 ΙμL 引物 Reverse primer， 6. 6 μ I无菌去离子水；
[0016] 反应条件：95°C 30s ;95°C 5s，60°C 30s，40 个循环；95°C 15s，60°C lmin，95°C 30s,60〇C 15s〇
[0017] 针对目前巴马香猪的养殖和生产中缺乏有效监测其机体脂肪沉积状况的措施，发 明人研宄发现，LPL基因的表达量与脂肪沉积成正相关，而脂肪含量的高低可由脂肪沉积的 情况体现出来，脂肪沉积又可以通过LPL基因的表达量确定，因此，LPL在脂肪组织中的相 对表达量可以用来反应巴马香猪的脂肪沉积状况。据此，发明人建立了一种基因 LPL检测 巴马香猪脂肪沉积的方法，利用基因 LPL在脂肪组织中的表达水平来检测巴马香猪脂肪沉 积。该法具有快速准确、操作方便且不影响猪正常生长的特点，适用于在巴马香猪养殖过程 中动态监控猪脂肪沉积情况以便于随时掌握猪生长状况，防止脂肪过度沉积以获得巴马香 猪的最佳胴体瘦肉率。
【附图说明】
[0018] 图1是基因 LPL在3月龄、5月龄、8月龄巴马香猪脂肪组织中的相对表达量条形 图。
[0019] 图2是基因 LPL在巴马香猪脂肪组织中的相对表达量与猪背膘厚度的相关性曲线 图。
【具体实施方式】
[0020] -、研宄设计
[0021] 对巴马香猪进行正常喂食处理，采集3月龄、5月龄、8月龄检测脂蛋白脂酶LPL的 表达水平，考察基因 LPL的表达量与脂肪沉积率的关系。
[0022] 利用NCBI数据库中公开发表的猪（sus scrofa)的LPL序列（序列登录号：Gene ID :397537 ;参见网址：NCBI 数据 http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/)，成功设对特异性 定量引物，可检测猪的基因组中其相对表达量。猪（sus scrofa)的LPL特异片段，序列全 长为2946bp。猪的看家基因甘油醛-3-脱氢酶基因 GAPDH特异片段，序列全长为1341bp。
[0023] 用于定量PCR上述LPL特异片段的引物对，其碱基序列为：
[0024] Forward primer (Pl) ：TGCTGGGAATCCAAACTGAA ；
[0025] Reverse primer(P2) ：TCTGG