赤瓜参多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能微生物多肽领域，具体涉及赤瓜参多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 海参，属棘皮动物，是一种古老的海洋软体生物。有着6亿多年的存活史，因其"性 温补、足敌山参"而胜名，在"海味八珍"中居首位，价值昂贵，为久负盛名的滋补珍品。海参 的营养价值极高，富含聚氨基葡萄糖、粘多糖、海洋生物活性钙、高蛋白、黏蛋白、多肽、胶原 蛋白、核酸、海参皂甙、硫酸软骨素、多种维生素、及各种氨基酸和碳水化合物等50多种养 分，是不可多得的不含胆固醇的高级滋补品。
[0003] 国际市场上海参消费需求的不断增加引起海参价格一路攀升，大大刺激了海参捕 捞业的发展。但海参的过度捕捞使许多商业品种资源遭到不同程度的破坏。而且在海参产 品加工过程中，海参肠等下脚料直接作为废料扔掉，这样不仅污染环境，而且海参下脚料中 的营养价值没有得到很好的开发。
[0004] 海参蛋白质的营养价值以多肽含量为标准，而多肽活性是决定其保健功能的核心 指标。海参多肽具有良好的溶解性和稳定性，易消化吸收，食用安全，具有降血压、预防心脑 血管疾病、提高免疫力、抗肿瘤、抗疲劳和抗氧化等生物活性。因此，肽制品已成为海参深度 开发的重要方向。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供分离的赤瓜参多肽，及其在制备用于改善心脑血管疾病以及 癌症治疗的药物中的应用。
[0006] 分离的多肽序列分别为：
[0007] UCGS-PJ-025 ：Met Gly Gly ThrTrpSerValSerArgCys
[0008] 2λ CGS-PJ-046 ：GlySerAlaAlaCysTyrLysArgValArgSerHisGluVal
[0009] 3、CGS-PJ-053 :HisGlyProGlyLeu
[0010] 4λ CGS-PJ-055 ：AlaPheTyrAspValGlyGlyAsnLysLysSerCysMet
[0011] 5λ CGS-PJ-078 ：GluAlaArgGlnLysLysGluGlyCysLeuProMetAspAspCysArg
[0012] 6、CGS-PJ-093 :
[0013] AlaCysCysMetGlnLysGluLysLysSerproSerPhePheAsnArgLysMetCys
[0014] CGS-PJ-121 ：
[0015] TyrArgSerValAspAlalleProTyrPheLysArgHisAspGluAlaSerGln
[0016] 8λ CGS-PJ-136 ：CysSerGluLeuProPheMetAsnLysLysArgSerGluMetValAla
[0017] 9λ CGS-PJ-152 ：LysHisAspArgTrpAlaSerLysSerGluGluGluTrp
[0018] 10λ CGS-PJ-160 ：ValProTyrPheGluAspLysGlyGlySerMetTrpPheSer
[0019] IK CGS-PJ-I72 ：GlnAspTyrArgHisHisGluLysAsnArgCysLysIIeGlyGlySerTyr
[0020] 本发明提供一种用于分离赤瓜参多肽的方法，取新鲜赤瓜参，将参体打碎，用PBS 溶液溶解，加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶和丝氨酸蛋白酶进行分步骤酶解，酶解时间为每一 步lh，抑制酶活；所得酶解液6000g离心7min，上清液加入乙醇沉淀过夜，6000g离心7min， 所得上清液冻干，得到多肽混合物，以AOT即二（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠为变性剂的 非连续胶电泳系统对多肽混合物进行分析，分别回收不同分子量的多肽片段，并进行测序； 取不同大小的肽段进行抑制血管内皮细胞活性以及抗癌活性分析，得到了 11个具有较好 的活性的多肽。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1多肽的获得
[0022] 取长度大约为15cm的新鲜赤瓜参，将参体打碎，用4倍体积的pH为7. 0的PBS溶 液溶解，30摄氏度条件下加入适量的碱性蛋白酶、风味蛋白酶和丝氨酸蛋白酶进行分步骤 顺序酶解，酶解时间为每一步大约lh，并且分别都己酶解完全；升温抑制酶活；所得酶解液 6000g离心7min，上清液加入乙醇沉淀过夜，6000g离心7min，所得上清液冻干，得到多肽混 合物，以AOT即二（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠为变性剂的非连续胶电泳系统对多肽混 合物进行电泳分析，分别回收得到到不同分子量的多肽片段179条。
[0023] 实施例2多肽活性的检测
[0024] -、血管内皮细胞增殖活性的测定
[0025] 对数生长期的ECV304细胞，经0. 25%胰酶消化，用DMEM完全培养基制成lxl06mL。 细胞悬液，加入96孔培养板，每孔100皿。贴壁12h后，换为无血清的DMEM培养基继续培 养12h，使细胞生长同步于GO期。吸弃培养液，如表1所示将细胞分组，每组设立4个复孔。 分别加入不含或含有100 μ g/mL浓度分离的多肽的无血清DMEM培养基，于3TC、5% C02培 养箱中分别培养48h。分别加入不含或含有ox-LDL (终浓度为25pg/mL)的无血清DMEM培 养基作用12h，MTT法检测ECV304细胞的增殖。以酶标仪570nm处的吸光度（A值）表示细 胞增殖活性。通过分析这179个样本多肽，得到了具有活性的多肽11个，结果如下：
[0026] 表 1
[0027]
[0028] 从表1可以看出，这11个多肽都具有较强的抑制血管内皮细胞的活性。
[0029] 二、多肽对黑色素瘤细胞增殖率的影响
[0030] 取对数生长期的B16细胞，经0. 25%胰酶消化，以1?^1-1640完全培养基配成密度 为4xl04/mL的细胞悬液，接种子96孔培养板，200 μ 1/孔，置于37°C、5% COz的培养箱内 培养。贴壁24h后，弃培养液，分别加入含多肽（浓度为100 μ g/mL)的完全培养液，对照组 加等体积的完全培养基。每孔200 μ 1，设4个复孔，分别培养48h。于实验结束前4h加入 MTT溶液（5mg/mL)溶液200 μ 1孔，4h后弃上清，每孔加入200 μ 1酸化异丙醇，吹打至充分 溶解，于酶标仪570rim处测定吸光度（A)值，以A值表示细胞增殖活性。
[0031] 表2结果如下：
[0032]
[0033] 从表2的结果可以看出，分离的多肽具有较强的抑制黑色素瘤细胞的功能。
[0034] 实施例3多肽毒性及稳定性检测
[0035] 将分离的多肽分别注射到小白鼠体内，通过3周的培养，小白鼠没有明显的致病 性状。抽取小鼠尾血，仍然能够获得相应的多肽，这说明，多肽在小鼠体内具有较长的半衰 期。
【主权项】
1. 赤瓜参多肽，其序列包含SEQ ID NO :1-11任一项所示的序列。2. 权利要求1所述的多肽在制备用于改善心脑血管疾病的药物中的应用。3. 权利要求1所述的多肽在制备癌症治疗的药物中的应用。4. 一种制备权利要求1所述多肽的方法，取长度为15cm的新鲜赤瓜参，将参体打碎，用 4倍体积的pH为7. 0的PBS溶液溶解，30摄氏度条件下加入适量的碱性蛋白酶、风味蛋白酶 和丝氨酸蛋白酶进行分步骤顺序酶解，酶解时间为每一步大约lh，并且分别都已酶解完全； 升温抑制酶活；所得酶解液6000g离心7min，上清液加入乙醇沉淀过夜，6000g离心7min， 所得上清液冻干，得到多肽混合物，以A 0 T即二（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠为变性剂 的非连续胶电泳系统对多肽混合物进行电泳分析，通过活性检测即可获得相应的多肽。
【专利摘要】本发明涉及从赤瓜参中分离得到的多个短肽，这些短肽均具有能改善心脑血管疾病以及治疗癌症的作用。
【IPC分类】A61K38/08, A61K38/10, A61P35/00, C12P21/06, A61P9/00, C07K7/06, C07K7/08, C07K1/30
【公开号】CN104974223
【申请号】CN201510254250
【发明人】李静静, 周艳, 郑功才
【申请人】舟山拓智科技服务有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月12日