一种深海沉积物来源酯酶est22及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种深海沉积物来源酯酶EST22、其编码基因 及其应用。
【背景技术】
[0002] 酯酶（esteraseEC3. 1. 1. 1)广泛存在于微生物中，能够催化酯类化合物的水解 和合成。酯酶具有许多优良的特性，例如具有高度手性选择特异性，催化反应不需要辅酶和 辅因子，拥有较广的底物谱，在有机溶液中保持高稳定性等，使得酯酶在工业生产中成为重 要的催化剂。酯酶可广泛应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革 絹纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业等领域。
[0003] 微生物产生的酯酶种类多，不同来源的酯酶具有多方面不同性质，从而导致各具 特色的应用范围。因而需要持续不断地开发新特性酯酶以更好的满足工业需要。海洋来源 的酯酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温、以 及优异的手性选择性等等，因此，从海洋徼生物中筛选出独具特性的酯酶就成了开发新型 工业酶制剂的一个重要方向。宏基因组技术可从海洋环境中直接获取酶资源而不依赖于海 洋微生物菌株的培养，已成为海洋酯酶获取的重要手段。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种新的深海来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶 可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。
[0005] 本发明从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中，通过特异性底物（三丁酸甘油 酯）筛选获得一种新的酯酶基因Est22,经PCR、酶切、克隆和测序，酯酶基因Est22的核苷 酸序列如SEQIDNo. 1所示。酯酶基因Est22大小为1035bp，碱基组成为：236A(22. 80%)、 204T(19. 71% )、288C(27. 83% )和307G(29. 66% )，编码蛋白大小为344个氨基酸残基， 其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似 性最高的酯酶来源于丫-变形杆菌纲细菌61&(^6(： 〇1&?&111(1111&，相似性为71%(其在 GenBank数据库中的注册号为WP_006015116)。系统发育分析结果表明，酯酶Est22属于酯 酶家族中的第IV家族。氨基酸序列分析结果显示，酯酶Est22具有甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、 甘氨酸和甘氨酸组成的催化结构域（氨基酸位置为186至190)，构成酯酶催化中心，说明 Est22属于酯酶第IV家族⑶SAG亚家族。综上所述，Est22应为酯酶家族中的一名新成员。
[0006] 在不影响酯酶Est22蛋白活性前提下，可对SEQIDNO: 2所示的远离186-190氨 基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶 Est22活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结 构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三 维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由 于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产 生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶Est22突变体具有 至少与SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以上的同 源性，最优选具有至少99%以上的同源性。
[0007] 同理，本发明还保护对SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺 失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶Est22蛋白生物学活性的DNA分子。优 选的酯酶Est22突变体基因具有至少与SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列90%以上的同源 性，更优选具有至少95%以上的同源性，最优选具有至少99%以上的同源性。
[0008] 利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶Est22基因连接到合适的载体上，并转化 或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶Est22。合适的原核生物宿主包括各 种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳动物细胞（如中 国仓鼠卵巢细胞）等，优选采用原核表达系统E.coli。
[0009] 合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达 载体。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因Est22连接到大肠杆菌表达载体 pET28b(Novagen)上，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组醋 酶。通过酯酶活力测定表明，Est22酯酶或上述能表达Est22酯酶的宿主菌可用于水解短 链脂肪酸酯，例如C2-C10短碳链脂肪酸酯。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C10短碳链的 对硝基苯酚酯，例如对硝基苯乙酸酯、对硝基苯丁酸酯、对硝基苯己酸酯、对硝基苯辛酸酯 和对硝基苯癸酸酯等，其中底物为对硝基苯酚乙酸酯（C2)时催化活性最高，酶活达2065U/ mg〇
[0010] Est22酯酶催化水解温度范围为10~55°C，优选为35~45°C;所述水解的pH值为 5.0~10. 0,优选为6.0~8.0。在添加EDTA或有机溶剂二甲基亚砜、甲醇、TritonX-100、 吐温20和80条件下，酶学活性增大。
[0011] 本发明从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中筛选获得新的酯酶基因，发现了 该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。 获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产酯酶，为后续的工 业应用提供成本低廉的酯酶起始材料。该酶的生产可在洗涤剂、印染助剂和生物柴油制备 等工艺中显示出重要的经济和社会价值。
【附图说明】
[0012] 图1为纯化酯酶Est22的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。
[0013] 图2为酯酶Est22的底物特异性图。C2:对硝基苯乙酸酯；C4:对硝基苯丁酸酯、 C6 :对硝基苯己酸酯；C8 :对硝基苯辛酸酯；C10 :对硝基苯癸酸酯；C12 :对硝基苯十二酸 酯；C14 :对硝基苯十四酸酯；C16 :对硝基苯十六酸酯；定义底物为C2时测定值为100%。
[0014] 图3为酯酶Est22最适反应温度图。
[0015] 图4为酯酶Est22最适反应pH图。
[0016] 图5为二价阳离子对酯酶Est22活性影响图。
[0017] 图6为有机溶剂和去垢剂对酯酶Est22活性影响图。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1酯酶基因Est22的获取
[0019] 深海沉积物样品于2008年由深海可视多管取样器采集自太平洋海山边缘。宏 基因组文库构建米用CopyControl?HTPfosmidlibraryproductionkit(Epicentre Biotechnologies，美国），宿主菌株为E.coliEPI300(EpicentreBiotechnologies，美 国），载体为pCC2F0Sfosmidvector(EpicentreBiotechnologies，美国）。经脉冲场电泳 检测，插入片段大小为36~48kb。
[0020] 采用酯酶筛选平板筛选具有酯酶基因的克隆子。酯酶筛选培养基配方为LB培养 基（l〇g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH 7. 2)中加入10g/L三丁酸甘油 酯；灭菌后，无菌条件下加入氯霉素，使其终浓度为12. 5yg ml'取10yl文库菌液稀释 至100yl，涂布于酯酶筛选平板，30°C培养2天，菌落周围出现明显透明圈即为阳性克隆。 将阳性克隆挑出，经重复验证获得酯酶克隆E22。
[0021] 经重复验证的酯酶阳性克隆E22接入3ml LB液体培养基（含12. 5ygmr1氯霉 素和 6 yl CopyControl? Fosmid Autoinduction Solution)，37°C 250rpm 震荡培养 18h〇 采用质粒抽提试剂盒（Axygen，美国）提取fosmid质粒。携带醋酶基因的fosmid质粒采用 限制性内切酶Sau3AI进行不完全酶切，割胶回收1. 5~4kb大小的DNA片段，将其连接至 PUC19质粒，再转化入E. coli DH5a菌株，涂布于含有l〇〇yg mr1氨苄青霉素的酯酶筛选 培养基平板筛选阳性亚克隆。30°C培养2天后挑选产生透明圈的亚克隆，经划线重复验证 后测序，获得插入片段DNA序列。
[0022] 针对插入片段的序列，基于NCBIORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html)分析获得插入片段中开放阅读框信息，通过Blastx(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知酯酶基因序列的同源性。经数据库比对 分析获得Est22基因，大小为1035bp，碱基组成为：236A(22. 80 % )、204T(19. 71 % )、 288C(27. 83%)和307G(29. 66%)，其核苷酸序列如SEQIDNo:l所示。编码蛋白大小为 344个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDN〇:2所示。将该基因序列在GenBank中进行同 源搜索，与之相似性最高的酯酶来源于y-变形杆菌纲细菌Glaciecolapallidula，相似 性为71 %，其在GenBank数据库中的注册号为WP_006015116。
[0023] 系统发育分析结果表明，酯酶E