用于增强pcr特异性的新颖组合物、方法和试剂盒的利记博彩app

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【专利说明】用于増强PCR特异性的新颖组合物、方法和试剂盒
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C. 119(e)要求2012年12月20日提交的美国临时专利申请第 61/740, 242号的权益，和根据35U.S.C. 119(e)要求2012年11月2日提交的美国临时专利 申请第61/721，968号的权益，所述申请中的每一个在此以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明大体上涉及分子生物学领域。具体来说，本发明涉及适用于检测并且区分 核酸的新颖引物。
【背景技术】
[0004] 能够检测样品中的特定核酸分子的存在并对其进行定量的分析在法医学、医学、 流行病学和公共卫生中相当重要。所述分析可以用于例如鉴别传染病的病因，预测个体将 患上遗传疾病的可能性，测定饮用水或牛奶的纯度，或鉴别组织样品。提高所述分析的效用 和适用性的愿望通常因分析灵敏度而受阻。因此，非常希望研发出更灵敏的检测分析。
[0005] 核酸检测分析可以基于核酸分子的任何特征，例如其大小、序列，并且如果是DNA， 那么还可以基于通过限制性核酸内切酶消化的易感性。所述分析的灵敏度可以通过改变向 观察者报告或发信号通知检测结果的方式来提高。因此，举例来说，可以通过使用可检测地 标记的试剂来提高分析灵敏度。出于此目的，已经使用了多种多样的所述标记。可检测标 记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。
[0006] 虽然使用高度可检测标记的试剂可以改善核酸检测分析的灵敏度，但是所述分析 的灵敏度仍然受到一些因素的限制，所述因素包括（但不限于）非特异性反应，所述非特异 性反应增加了背景信号和区分相差一个或几个核苷酸的序列的限制。针对这些问题，已经 研发出了使用DNA扩增的各种检测和定量方法。
[0007] 通过聚合酶链式反应（PCR)扩增DNA使用引物对，所述引物的序列决定了扩增的 特异性。然而，在引发区以外的扩增子序列对扩增特异性的贡献极少或无贡献。在典型的 PCR反应中，使用正向和反向引物优先靶向并且扩增相关DNA序列。在TaqManli分析中，还 提供了从扩增子序列内选取的探针来选择性地检测并且监控扩增产物。目标序列中在引物 和探针区以外的其余部分不采用。仍然需要提高扩增反应的特异性，尤其是对于相差一个 或几个核苷酸的样品的扩增来说。所述分析的实例包括（但不限于）基因分型、稀有等位 基因检测和突变体序列的预扩增。

【发明内容】

[0008] 本文中提供了用于检测目标核酸分子的组合物、方法和试剂盒。
[0009] 一方面，提供寡核苷酸（本文中称为"STAR(目标特异性扩增限制）引物"或"* 引物"），其包含（i)序列标签，本文中称为"STAR标签序列"和（ii)某一序列，所述序列与 目标核酸杂交并且引物从其延伸，拷贝目标核酸，产生延伸产物。STAR标签序列与STAR引 物的延伸产物3'的部分互补，延伸产物的互补部分在本文中被称作STAR标签目标区。当 STAR引物杂交到目标核酸并且延伸时，延伸产物包含在5'端的STAR标签序列和在延伸产 物的3'区中的STAR标签序列的互补序列（即，STAR标签目标区）。因此，STAR引物延伸 产物可以回折自退火，由此形成茎-环结构。
[0010] 在某些实施例中，STAR标签序列在STAR引物的5'端或在STAR引物的5'端附近。 在某些实施例中，STAR标签序列与用于在扩增反应中扩增延伸产物的另一个引物序列的结 合位点的全部或一部分互补。
[0011] 一方面，提供包含STAR引物的组合物。在某些实施例中，提供包含第一寡核苷酸 引物和第二寡核苷酸引物的组合物，其中第一引物包含与第二引物的目标核酸杂交序列的 全部或一部分相同的STAR标签序列。在某些实施例中，第一和第二引物是正向和反向扩增 引物对。
[0012] 在某些实施例中，提供正向和反向扩增引物对，其中在所述对中的至少一个中包 含与另一个引物的目标核酸杂交序列的全部或一部分相同的STAR标签序列。在某些实施 例中，所述对的两个引物均包含STAR标签序列。
[0013] 一方面，提供多核苷酸延伸产物，其包含在5'端的STAR标签序列和与STAR标签 序列的3'侧的STAR标签序列互补的序列，其中所述STAR标签序列和所述互补序列使得延 伸产物能够形成茎-环结构。
[0014] 另一方面，STAR引物可以用作用于增强PCR特异性的通用又便利的工具。
[0015] 在某些实施例中，提供用于抑制或实质上减少目标核酸的不当扩增的方法，所述 方法包含使目标核酸与一或多个STAR引物接触，其中所述STAR引物包含5' STAR标签序 列；并且延伸STAR引物以形成延伸产物，借此延伸产物抑制或实质上减少了目标核酸的不 当扩增。
[0016] 在某些实施例中，提供用于检测一或多个目标核酸分子的方法，所述方法包含使 一或多个目标核酸分子与一或多个STAR引物杂交，其中所述STAR引物包含5' STAR标签序 列；延伸STAR引物以形成一或多个延伸产物；扩增延伸产物以形成一或多个扩增产物；以 及检测存在或不存在至少一个扩增产物，由此检测一或多个目标核酸分子。
[0017] 在某些实施例中，提供用于检测一或多个目标核酸分子的方法，所述方法包含使 一或多个目标核酸分子与一或多个STAR引物杂交，其中所述STAR引物包含5' STAR标签序 列；延伸STAR引物以形成一或多个延伸产物；在存在检测器探针的情况下扩增延伸产物以 形成一或多个扩增产物，其中所述检测器探针包含STAR引物的至少一个核苷酸；以及检测 存在或不存在至少一个扩增产物，由此检测一或多个目标核酸分子。
[0018] 在某些实施例中，提供用于区分甲基化与非甲基化目标核酸的方法。在某些实施 例中，提供用于从单一杂交反应检测两个或两个以上不同目标核酸的方法。在某些实施例 中，提供用于区分目标核酸样品中的两个不同等位基因的方法。
[0019] 在某些实施例中，提供组合物，其中所述组合物包含一或多个核酸分子和至少一 个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含STAR标签序列并且其中所述寡核苷酸是本发明寡核 苷酸。在某些实施例中，所述组合物进一步包含核酸聚合酶。在某些实施例中，所述组合物 进一步包含正向或反向引物。在某些实施例中，所述组合物进一步包含检测器探针。
[0020] 在某些实施例中，提供试剂盒，所述试剂盒可以用于使用本文中所述的寡核苷酸 进行杂交、延伸和扩增反应。在某些实施例中，提供用于检测或测量核酸合成或扩增产物的 试剂盒，所述试剂盒包含一或多种本文中所公开的寡核苷酸，包括STAR引物。
[0021] 本文中提供了本传授内容的这些和其它特征。
【附图说明】
[0022] 图1示意性地描绘根据本文中所公开的某些实施例的STAR引物的设计。
[0023] 图2示意性地描绘STAR引物的替代性设计和应用：图2A描绘替代性STAR引物设 计；图2B描绘在甲基化检测中使用STAR引物；以及图2C描绘使用STAR引物用通用探针进 行基因分型。
[0024] 图3示意性地描绘与目标序列上的引物结合位点具有不同重叠长度的STAR引物。
[0025] 图4以图形方式表示具有不同重叠长度的STAR引物对目标序列和脱靶序列的扩 增遏制：含完全匹配（PM) STAR标签的目标序列（菱形线）、含PM STAR标签的脱靶序列（正 方形线）、含错配（MM) STAR标签的目标序列（三角形线）和含丽STAR标签的脱靶序列（圆 形线）。
[0026] 图5示意性地描绘下一代TaqManlf miRNA分析工作流的实施例，使用了 5'和3' 连接衔接子（或连接子）、5'和3'连接夹板以及STAR引物。
[0027] 图6以图形方式表示相比于对照引物，在使用STAR引物的情况下，衔接子（连接 子）扩增减少。
[0028] 图7以图形方式表示相比于对照引物，使用STAR引物使目标miRNA的qPCR检测 的灵敏度增加。
[0029] 图8示意性地描绘用于区分人类let_7c和let_7b miRNA的分析，使用了标准正 向引物并且使用了 STAR正向引物。
【具体实施方式】
[0030] 本文中提供了用于检测目标核酸的组合物、方法和试剂盒。
[0031] 通过PCR扩增DNA需要引物对，所述引物的序列决定了扩增的特异性。然而，在构 造引物或探针序列的过程中通常不使用在引发区以外的扩增子序列。当引物特异性有限 时，尤其当所要目标和不需要的目标仅仅是其内部序列不同时，两者均可以通过相同的引 物对扩增。因此，需要采用内部扩增子序列进行进一步区分。为此目的，设计并测试了本文 中所公开的序列靶向扩增限制性（STAR)引物，用于选择性地扩增所要目标同时同步抑制 不需要的扩增产物的形成。
[0032] STAR引物寡核苷酸（也称为引物"）包含⑴含STAR标签序列的部分和（ii) 含某一序列的部分，所述序列与目标核酸杂交并且引物从其延伸，拷贝目标核酸，产生延伸 产物。STAR标签序列与STAR引物的延伸产物3'的部分互补，延伸产物的互补部分在本文 中被称作STAR标签目标区。当STAR引物杂交到目标核酸并且延伸时，延伸产物包含在5' 端的STAR标签序列和在延伸产物的3'区中的STAR标签序列的互补序列（即，STAR标签 目标区）。因此，STAR引物延伸产物可以回折自退火，由此形成茎-环结构。STAR引物被 设计成具有能够在延伸产物中形成茎-环结构的5'STAR标签序列并且可以针对引物区、探 针区或延伸产物的任何扩增子内部序列设计STAR标签序列，为具有挑战性的应用提供优 良的设计灵活性。
[0033] 在某些实施例中，STAR标签序列在STAR引物的5'端或在STAR引物的5'端附近。 在某些实施例中，STAR标签序列不与STAR引物的目标延伸识别序列重叠。在某些实施例 中，STAR标签序列部分地，但不完全地与STAR引物的目标延伸识别序列重叠。目标延伸识 别序列是指STAR引物中杂交到目标核酸并且引物从其延伸以形成延伸产物的部分。在某 些实施例中，目标延伸识别序列对目标核酸具有特异性。在某些实施例中，目标延伸识别序 列是针对通用序列，例如在连接到目标核酸末端的常见衔接子中。在某些实施例中，目标延 伸识别序列包含Poly(T)序列，用于例如杂交到聚腺苷酸化目标核酸。
[0034] 在某些实施例中，STAR标签序列与用于在扩增反应中扩增延伸产物的另一个引物 序列的结合位点的全部或一部分互补（参看例如图1)。当STAR引物被延伸时，延伸产物可 以自身回折，由此在延伸产物的5'端处的STAR标签序列与延伸产物的3'区中的STAR标 签序列的互补序列之间形成茎-环结构。通过STAR引物延伸产物形成的茎-环结构不包 括用于扩增目标分子的另一个引物的退火，由此抑制了不需要的目标的扩增。
[0035] 在某些实施例中，STAR标签序列与一部分扩增子内部序列互补。在某些实施例中， STAR标签序列与一部分内部扩增子序列互补并且与另一个引物序列的结合位点互补。通过 这种STAR引物的延伸产物形成的茎-环结构阻断了另一个引物的退火或通过DNA聚合酶 延伸，由此阻断了延伸产物的任何进一步扩增。
[0036] 在某些实施例中，扩增反应中的正向引物是STAR引物。在某些实施例中，扩增反 应中的反向引物是STAR引物。在某些实施例中，扩增反应中的正向和反向引物均是STAR 引物。
[0037] 在某些实施例中，提供一种STAR引物，其包含与所述STAR引物所靶向的核酸中的 序列相同的STAR标签序列。举例来说，在一些实施例中，STAR引物包含与所靶向的核酸中 的引物杂交序列相同的STAR标签序列。在某些实施例中，STAR引物包含与所靶向的核酸 的一部分相同的STAR标签序列，所述部分是所靶向的核酸中引物杂交序列的3'。在某些 实施例中，STAR引物包含与引物杂交序列的全部或一部分和所靶向的核酸的一部分相同的 STAR标签序列，所述部分是所靶向的核酸中引物杂交序列的3'。在所述实施例中，通过杂 交到目标核酸的STAR引物延伸经过目标核酸的另一个引物杂交序列形成的延伸产物具有 两个互补序列部分，其允许延伸产物形成茎-环结构。
[0038] 在某些实施例中，提供一种多核苷酸延伸产物，其包含在5'端的STAR引物和与 STAR引物的STAR引物3'的STAR标签序列互补的序列以使得延伸产物能够使用所述互补 序列形成茎-环结构。在某些实施例中，基于STAR引物的延伸产物能够在PCR延伸温度下 形成茎-环结构。在某些实施例中，茎-环结构中基于STAR引物的延伸产物不包括不同引 物到延伸产物的退火。
[0039] 在某些实施例中，STAR引物可以被设计成包含5' STAR标签序列，其可以在引物延 伸之后在PCR延伸温度下形成茎-环结构（参看图2A)。可以选择与用于扩增目标分子的 另一个引物完全或部分地重叠的STAR标签序列以排除另一个引物的退火。不希望受特定 理论束缚，似乎茎-环的形成比引物退火到目标分子要快并且由于熵有利，所以茎-环结构 更稳定。因此，STAR引物有效地阻止了另一个引物的退火和延伸，促使PCR效率大大降低。
[0040] 在某些实施例中，提供STAR引物寡核苷酸，其中STAR标签序列被设计成用于在 PCR中回环并延伸（参看例如图2A)。在某些实施例中，STAR引物中的5'最末端序列被设 计在用于靶向扩增子内所含的特定序列（参看图2A中引物和扩增子中的"X"）的引发结构 域的相同链中。在第二轮PCR中，所述序列可以从另一个引物延伸，借此其回折并且当完全 匹配时自我复制5'序列，由此使得延伸产物不可用于扩增。STAR引物的5'端可以被设计 成与目标相同用于遏制扩增。含与STAR标签序列错配的目标核酸正常扩增。
[0041] 在某些实施例中，提供一种组合物，其包含第一和第二引物，其中第一引物包含与 第二引物的目标结合序列的全部或一部分相同的STAR标签序列。在某些实施例中，组合物 中的第一和第二引物之间共用的相同序列的长度介于约3与约15个核苷酸之间。在某些 实施例中，共用序列的长度是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
[0042] 在某些实施例中，提供扩增引物对，其中在所述引物中的至少一个中包含STAR标 签序列，其中STAR标签序列包含另一个引物的目标结合序列的全部或一部分。在某些实施 例中，包含STAR标签序列的引物是正向引物并且另一个引物是反向引物。在某些实施例 中，包含STAR标签序列的引物是反向引物并且另一个引物是正向引物。在某些实施例中， 扩增引物对的两个引物均包含STAR标签序列。
[0043] 在某些实施例中，STAR引物长度介于约20-60个核苷酸之间。在某些实施例中， STAR引物的长度是约20到约50个核苷酸。在某些实施例中，STAR引物的长度是约20到 约45、约25到约50、约25到约45或约30到约40个核苷酸。在某些实施例中，STAR引物 的长度是约 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45 个核苷酸。
[0044] 在某些实施例中，STAR标签序列的长度是约10到约40个核苷酸。在某些实施例 中，STAR标签序列长度介于约30-35个核苷酸之间。在某些实施例中，STAR标签序列的长 度是约10到约30、约10到约35、约10到约20、约15到约30、约15到约25、约20到约40、 约20到约25或约30到约40个核苷酸。
[0045] 在某些实施例中，STAR引物是正向引物。在某些实施例中，STAR引物是反向引物。 在某些实施例中，STAR标签序列完全包含在第二引物结合区内。在某些实施例中，STAR标 签序列完全包含在第二引物结合区的目标序列下游内（即，在有待扩增的目标核酸的区域 中）。在某些实施例中，STAR标签序列桥接第二引物结合区与有待扩增的目标核酸。在某些 实施例中，STAR标签序列与第二引物结合区的重叠可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12或13个核苷酸。优选地，这个重叠是11、12或13个核苷酸。在特定实施例中，STAR标 签序列与第二引物结合区的重叠是12个核苷酸。在某些实施例中，STAR标签序列与第二引 物结合区的目标序列下游的重叠可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。 优选地，这个重叠是11、12或13个核苷酸。在特定实施例中，STAR标签序列与第二引物结 合区的目标序列下游的重叠是12个核苷酸。在某些实施例中，STAR标签序列与目标核酸 完全匹配。在某些实施例中，STAR标签序列含有与目标核酸的错配。
[0046] 在某些实施例中，STAR引物可以用作用于增强PCR特异性的通用又便利的工具。 STAR引物可以广泛适用于基因分型、单核苷酸多态性（SNP)检测、稀有等位基因检测、突变 体序列的预扩增、稀有突变体检测、DNA甲基化分析、不需要的背景DNA的选择性遏制、文库 扣除等中。另外，STAR引物可以用于在衔接子连接的miRNA的预扩增中所连接的连接衔接 子的选择性扩增遏制和同源miRNA的TaqMan^+析区分（参看2012年11月2日提交的 共同拥有共同未决的美国临时专利申请第61/721，968号，和与此并行地提交的名称为"小 RNA 捕获、检测和定量（Small RNA Capture, Detection and Quantif