一种11α-羟基-16α,17α-环氧黄体酮的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种11 α -羟基-16 α，17 α -环氧黄 体酮的生产方法。
【背景技术】
[0002] 16 α，17 α -环氧黄体酮全称16 α，17 α -环氧-孕甾-4-烯-3, 20-二酮，俗称沃 氏氧化物，其C11-α -羟化物是激素药物生产中重要中间体。目前国内16 α，17 α -环氧黄 体酮的C11- α -羟化物主要利用黑根霉进行微生物羟化来完成，产率一般在45%_75%之间， 且底物投料浓度低（lg/L)，发酵条件及操作要求较高，副产物种类较多。
[0003] 以下为16 α，17 α -环氧黄体酮的Cn- α -羟化反应式：
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明的目的，在于提供一种11 α -羟基-16 α，17 α -环氧黄体酮的生产方法， 利用赭曲霉进行微生物羟化，采用流加的方法增加底物投量，提高16 α，17 α -环氧黄体酮 C11- α -羟化的转化率，且底物溶剂可以回收循环利用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种11 α -羟基-16 α，17 α -环氧黄体酮的生产方法，所述方法通过发酵赭曲霉、 羟化16 α，17 α -环氧黄体酮得到16 α，17 α -环氧黄体酮C11- α -羟化物。
[0008] 根据本发明，所述发酵赭曲霉为二级发酵，所述一级发酵和二级发酵的培养基均 为葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0. 2%、泡敌0. 02%配制而成的，均在121°C灭菌 30min〇
[0009] 根据本发明，所述16 α，17 α -环氧黄体酮Cll-α -羟化物是在二级发酵罐中流加 入底物16 α，17 α -环氧黄体酮经羟化得到的。
[0010] 根据本发明，所述底物16α，17α-环氧黄体酮1%与Ν，Ν-二甲基甲酰胺2%、吐 温-800. 3%混合加热至130°C溶清，流加入二级发酵罐。
[0011] 根据本发明，流加时间59~86h，维持发酵pH6. 0~7. 0,转速200rpm。
[0012] 根据本发明，所述赭曲霉的一级发酵为初始pH5.0,温度为28°C时接入赭曲霉种 子，维持罐压0. 04~0. 06MP，培养12h。
[0013] 根据本发明，所述赭曲霉种子是由赭曲霉菌接种到小米培养基中获得的，于27°C 培养箱中培养8天，接种前用无菌水洗脱。
[0014] 根据本发明，所述赭曲霉的二级发酵为初始pH5. 0,温度为28°C时，以10%的接种 量移入一级发酵的种子液，维持罐压〇. 04~0. 06MP，发酵4~10h，进行底物流加。
[0015] 采用本发明的发酵工艺，其底物转化90%以上。
[0016] 本发明的有益效果是，本发明提供的工艺方法提高了底物投量及转化率，且底物 溶剂可以回收循环利用，降低生产成本，减少环境污染。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例，对本发明的Ila-羟基-16 α，17 α-环氧黄体酮的生产方法作 进一步详细说明。
[0018] 本发明所述的赭曲霉，购自中科院北京微生物研究所，菌号CGMCC3. 06281。
[0019] 实施例1 :
[0020] 步骤1、制备斜面种子：将赭曲霉菌株接入灭菌好的小米培养基，于27°C培养箱中 培养8天，接种前用无菌水洗脱；
[0021] 步骤2、一级种子发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌 0. 02%配制一级种子培养基3L，121°C灭菌30min，降温至28°C，初始pH5. 0时接入步骤1中 的斜面种子，培养12h;
[0022] 步骤3、发酵罐发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0. 2%、泡敌0. 02% 配制二级发酵培养基l〇L，121°C灭菌30min，降温至28°C，初始pH5. 0,转速200rpm，以10% 接种量移入步骤2的一级种子，培养6h，菌量达40%~50% ;
[0023] 步骤4、底物流加：将16 a，17 a -环氧黄体酮l〇〇g、N，N-二甲基甲酰胺200g、吐 温-8030g混合加热至130°C溶清后，流加入发酵液中，维持pH6. 0,转速200rpm，流加59h， 16 a，17 a -环氧黄体酮转化率为90. 4%。
[0024] 实施例2 :
[0025] 步骤1、制备斜面种子：将赭曲霉菌株接入灭菌好的小米培养基，于27°C培养箱中 培养8天，接种前用无菌水洗脱；
[0026] 步骤2、一级种子发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0. 2%、泡敌 0. 02%配制一级种子培养基3L，121°C灭菌30min，降温至28°C，初始pH5. 0时接入步骤1中 的斜面种子，培养12h;
[0027] 步骤3、发酵罐发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0. 2%、泡敌0. 02% 配制二级发酵培养基18L，121°C灭菌30min，降温至28°C，初始pH5. 0,转速200rpm，以10% 接种量移入步骤2的一级种子，培养4h，菌量达20%左右；
[0028] 步骤4、底物流加：将16 a，17 a -环氧黄体酮180g、N，N-二甲基甲酰胺360g、吐 温-8054g混合加热至130°C溶清后，流加入发酵液中，维持pH6. 0,转速200rpm，流加78h， 16 a，17 a -环氧黄体酮转化率为90. 72%。
[0029] 实施例3 :
[0030] 步骤1、制备斜面种子：将赭曲霉菌株接入灭菌好的小米培养基，于27°C培养箱中 培养8天，接种前用无菌水洗脱；
[0031] 步骤2、一级种子发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0.2%、泡敌 0. 02%配制一级种子培养基3L，121°C灭菌30min，降温至28°C，初始pH5. 0时接入步骤1中 培养好的斜面种子，培养12h ;
[0032] 步骤3、发酵罐发酵：按葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、硫酸铵0. 2%、泡敌0. 02% 配制二级发酵培养基18L，121°C灭菌30min，降温至28°C，初始pH5. 0,转速200rpm，以10% 接种量移入步骤2的一级种子，培养10h，菌量达40%~50% ;
[0033] 步骤4、底物流加：将16 α，17 α -环氧黄体酮180g、N，N-二甲基甲酰胺360g、吐 温-8054g混合加热至130°C溶清后，流加入发酵液中，维持pH7. 0,转速200rpm，流加86h， 16 α，17 α -环氧黄体酮转化率为91. 14%。
【主权项】
1. 一种11 a -羟基-16 a，17 a -环氧黄体酮的生产方法，其特征在于，所述方法通过发 酵赭曲霉、羟化16 a，17 a -环氧黄体酮得到16 a，17 a -环氧黄体酮C11- a -羟化物。2. 如权利要求1所述的11 a _羟基-16 a，17 a -环氧黄体酮的生产方法，其特征在于， 所述发酵赭曲霉为二级发酵。3. 如权利要求1所述的11 a _羟基-16 a，17 a -环氧黄体酮的生产方法，其特征在于， 所述16 a，17 a -环氧黄体酮C11- a -羟化物是在二级发酵罐中流加入底物16 a，17 a -环 氧黄体酮经羟化得到的。4. 如权利要求1所述的11 a _羟基-16 a，17 a -环氧黄体酮的生产方法，其特征在于， 所述底物16 a，17 a -环氧黄体酮1%与N，N-二甲基甲酰胺2%、吐温-800. 3%混合加热至 130°C溶清，流加入二级发酵罐。5. 如权利要求4所述的11 a -羟基-16 a，17 a -环氧黄体酮的生产方法，其特征在于， 流加时间为59~86h，维持发酵pH6. 0~7. 0,转速200rpm。6. 如权利要求2所述的11 a-羟基-16 a，17 a-环氧黄体酮的生产方法，其特征在 于，所述赭曲霉的一级发酵为初始PH5. 0,温度为28°C时接入赭曲霉种子，维持罐压0. 04~ 0? 06MP，培养 12h。
【专利摘要】本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的生产方法。所述方法通过发酵赭曲霉、羟化16α,17α-环氧黄体酮得到16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物，所述发酵赭曲霉为二级发酵，所述16α,17α-环氧黄体酮C11-α-羟化物是在二级发酵罐中流加入底物16α,17α-环氧黄体酮经羟化得到的，其流加时间59～86h，维持发酵pH6.0～7.0。本发明的工艺方法，底物流加时，在发酵罐中流加59～86h，16α,17α-环氧黄体酮转化90%以上，且具有操作简便，生产周期短，底物溶剂可回收以实现循环利用，具有降低生产成本，经济环保等优点。
【IPC分类】C12P33/20, C12R1/66, C12P33/10
【公开号】CN104946720
【申请号】CN201410118939
【发明人】张道森, 柏挺, 吴庆安, 周秋火
【申请人】上海新华联制药有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月27日