一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微杆菌及其完全降解赤霉烯酮的应用。
【背景技术】
[0002]赤霉烯酮(zearalenone，ZEN),又称为F_2毒素，是一种具有类雌激素生物活性的霉菌毒素，主要是由镰刀属)真菌的某些种，如禾谷镰刀菌{Fusariumgraminearum)等通过聚酮类合成代谢途径生成。能导致人或动物的生殖系统紊乱，临床表现为雌激素过多症，还有潜在致癌性与肝肾损伤能力。镰刀菌生态适应性强，既营寄生又营腐生生活，分布广泛。赤霉烯酮物化性质稳定，不溶于水，难于清除。农作物生长、收获和储存、加工等多个环节中，都极易被镰刀菌侵害而污染赤霉烯酮。
[0003]近些年全球各地越来越多地在谷物(如玉米等)中检测出赤霉烯酮，严重威胁着食用者的健康安全和养殖业的饲料安全。
[0004]微杆菌属577.)是一种在土壤中广泛分布的常见革兰氏阳性菌，不生孢，不抗酸。不运动或以I?3根鞭毛运动。好氧，弱厌氧。在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖琼脂上菌落不透明，有光泽，黄色。化能异养菌，以呼吸代谢为主，也可能弱发酵产酸。营养要求复杂。最适生长温度30°C。已报道微杆菌属菌株可以降解黄原胶、壳聚糖、氯乙酰及多种含苯环化合物，目前尚无关于降解赤霉烯酮的微杆菌属菌株的报道。
[0005]本发明从青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243 E100.32.285)中筛选到一株具有赤霉稀酮降解能力的微杆菌属菌株，命名为577.FY1538，菌株保藏号为:CGMCC N0.10614，其发酵上清液可以完全降解赤霉烯酮。该菌可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一株可以降解赤霉烯酮的微杆菌属的菌株Microbacteriutn sp.FYl538，以及其应用。
[0007]本发明提供的微杆菌属的菌株，是从青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243E100.32.285)中分离获得，该菌种保藏号为CGMCC N0.10614，保藏日期为2015年3月11号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所。对该菌株的16S rDNA (SEQ ID NO 1)，表明该菌株来源于细菌中的微杆菌属，命名577.FY1538。其16S rDNA序列与 Microbacterium paraoxydans>Microbacterium菌种相似度均为 97%。该菌株在LB平板上生长的菌落为圆形，培养36h后直径大约1.5mm，不透明，有光泽，黄色(见图1)，革兰氏染色及显微镜观察，该菌株为革兰氏阳性菌(见图2 )。
[0008]本发明还提供利用Microbacterium寧FY1538菌株培养液上清完全降解赤霉稀酮的方法。具体步骤为:将所述菌株培养在LB液体培养基中(LB培养基的组成为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.4，水溶液)；添加终浓度5-15 μ I/ml的甲醇(优选终浓度10-12 μ I/ml);培养温度为25-35°C，震荡或者搅拌培养，转速为100-800rpm，培养时间为24-72小时(优选培养时间为48-60小时)；对Microbacterium sp.FY1538的培养液，通过离心或者过滤的方法去除菌体，获得培养液上清溶液；将该培养液上清在30-50°C条件下，与赤霉烯酮经过20-24小时的反应。用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留，用HPLC的方法分析赤霉烯酮的降解，表明赤霉烯酮已完全降解(图3，图4)。
[0009]本发明提供的菌株#/(^0如<^6?/^仰？ 5/7.FY1538可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
【附图说明】
[0010]图1.Microbacterium sp.FY1538菌落形态图。该菌株在LB平板上菌落为圆形较小，不透明，有光泽，黄色。该菌落形态的特征与微杆菌属细菌形态特征相符合。
[0011]图2.Microbacterium sp.FY1538细胞经过革兰氏染色后在显微镜下的形态。与革兰氏阳性菌特征吻合。
[0012]图3.TLC方法分析赤霉稀酮的降解。Mi crobac teri um sp.FYl 538在含有甲醇的LB培养基中的培养48小时后，取发酵液上清与赤霉烯酮在30°C条件下反应24小时后，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解，用TLC方法分析反应体系中赤霉烯酮的残留。TLC的展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙醋=5:4:1。泳道1-,Microbacterium sp.FY1538菌株在含甲醇的LB中培养2天后的培养液上清；泳道2:赤霉烯酮标准样；泳道3:Microbacterium sp.FY1538在加甲醇的LB中培养2天后的培养液上清与赤霉稀酮反应24小时。
[0013]图4:HPLC的方法分析赤霉稀酮的降解。Microbacterium sp.FY1538培养液上清与赤霉烯酮在30°C条件下反应O小时、I小时，3小时、6小时和20小时后，用HPLC(Agilent Eclipse Plus C18)分析反应体系中赤霉稀酮的残留。HPLC流动相为甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nm。蓝色:0小时；红色:催化反应I小时；绿色:催化反应3小时；粉色:催化反应6小时；黄色:催化反应20小时。
【具体实施方式】
[0014]所用实验材料和相关操作方法如下，未详述处可以参考冷泉实验室的《分子克隆》(J.Sambrook, et al.,第二版，1996):
1.培养基
LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为水，pH 7.4。
[0015]2.实验试剂:甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、环戊酮，各种无机盐类购于国药集团化学试剂(沪试)，分析纯；赤霉烯酮购于Sigma公司(货号Z2125);引物合成和DNA测序由上海杰李生物技术有限公司完成。TLC展开剂用石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1配制而成，现用现配。
[0016]3.TLC的分析方法:用sp.FY1538降解赤霉稀酮的方法:将Mi crobac teri um sp.FY1538接种于50 mL LB培养基中，添加终浓度10 μ Ι/ml的甲醇，30°C，震荡培养48 h ;取发酵液12000印111离心，其上清，每500 ^1加入25^8赤霉烯酮，在30°C水浴反应24h后，用适量乙酸乙酯萃取反应液，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解析出物，用TLC方法(MERCK公司TLC硅胶板60F254，展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:I)检验赤霉稀酬残留。
[0017]4.HPLC 的分析方法:将 #icro如Cieriws sp.FY1538 接种于 50 mL LB 培养基中，添加终浓度10 μ I/ml的甲醇，30 °C，震荡培养48 h ;发酵液12000rpm离心，上清液每500 μ I加入25 μ g赤霉烯酮，在30°C水浴反应不同时间，用HPLC进行分析。HPLC层析柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为甲醇和水，甲醇5%_100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nmo
[0018]实施例1:赤霉烯酮降解菌株的筛选分离与鉴定
土壤样品采自青藏高原青海湖边的草皮(N36.34.243 E100.32.285)。取2 g 土样，加AlO mL 0.15M氯化钠水溶液，振荡30 min，使样品充分打散后，室温静置lmin，立刻取ImL上清，涂布于LB平板上，30°C培养至单克隆生长，挑取不同形态单菌落，接种于液体LB培养基中(添加甲醇溶解的终浓度25 μ g/ml的赤霉烯酮)，30°C培养2天，离心取上清，用适量乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯蒸干并用少量甲醇溶解析出物，用TLC方法(展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1)检验培养液中赤霉烯酮的残留。由此将可以降解赤霉烯酮的菌群在LB平板上反复划线纯化单克隆，最终筛选到一株可以独立降解赤霉烯酮的单一菌株(图Do革兰氏染色后，证明该菌株是革兰氏阳性菌(图2)。
[0019]对该菌株抽提基因组DNA，PCR扩增16S rDNA。扩增用引物序列为16S rDNA通用引物 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (SEQ ID NO 2))和 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO 3))。得到该菌株 16S rDNA 序列(SEQ ID NO I)，在 genbank 数据库(http: //www.ncb1.nlm.nih.rov/)中进行比对分析，结果表明该赤霉稀酮降解菌株属于微杆菌属，命名为Microbacterium 5/?.FY1538，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10614。
[0020]实施例2: Mi crobac teri um 5/?.FYl 538 的发酵培养
Microbacterium印.FY1538菌株发酵上清用来降解赤霉稀酮，需要用甲醇诱导。对菌株进行分离纯化后，挑取单菌落接种于50 mL LB培养基中，添加终浓度10 μ Ι/ml的甲醇，30 0C，震荡培养48 h后，发酵液12000rpm离心，获得发酵上清液。
[0021]实施例3: Mi crobac teri um 5/?.FY1538发酵上清液降解赤霉稀酮的能力分析取发酵上清液500 μ1，加入25ug赤霉烯酮，在30°C水浴反应24小时，用100yl乙酸乙酯萃取反应液，收集乙酸乙酯相，蒸干并用少量甲醇溶解析出物，用TLC方法(MERCK公司TLC娃胶板60F254，展开剂为石油醚:丙酮:乙酸乙醋=5:4:1)检验赤霉稀酮残留。如图3所示，Mi crobac teri um sp.FYl 538发酵上清液与赤霉稀酮催化反应24小时后，TLC方法检测不到反应体系中的赤霉稀酮。
[0022]进一步用HPLC分析Microbacterium sp.FY1538发酵上清液在不同反应时间内降解赤霉稀酮的能力。HPLC层析柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脱30min，紫外检测波长240nm。如图4所示，反应时间I小时，3小时，6小时，反应液中的赤霉烯酮逐渐下降，反应20小时后，HPLC已经检测不到反应体系中的赤霉稀酮，说明Microbacterium sp.FYl538发酵上清液具有完全完全降解赤霉稀酮的能力。
[0023]本发明提供的菌株#/<^9如<^6?/./? 5/7.FY1538可应用于玉米等发霉谷物的脱毒。
【主权项】
1.一株微杆菌属菌株，能够完全降解赤霉稀酮，命名为FY1538，菌种保藏号为CGMCC N0.10614。2.如权利要求1所述的微杆菌属菌株完全降解赤霉烯酮的应用。3.如权利要求1所述的微杆菌属菌株完全降解赤霉烯酮的应用，其特征在于具体步骤为:将所述菌株培养在LB液体培养基中，添加终浓度5-15 μ Ι/ml的甲醇；培养温度为25-35 °C，震荡或者搅拌培养，转速为100-800rpm，培养时间为24-72小时；对Microbacterium sp.FY1538的培养液，通过离心或者过滤的方法去除菌体，获得培养液上清溶液；将该培养液上清在30-50°C条件下，与赤霉烯酮经过20-24小时的反应。4.如权利要求1所述的微杆菌属菌株在发霉谷物脱毒中的应用。
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体为一种完全降解赤霉烯酮的微杆菌及其应用。本发明发现一株微杆菌可以降解赤霉烯酮，命名为Microbacteriumsp. FY1538。该微杆菌属于微杆菌属（Microbacterium sp.），分离自青藏高原青海湖边的草皮（N36.34.243E100.32.285）。Microbacteriumsp. FY1538在LB培养基中培养，添加终浓度10ul/ml的甲醇，培养基pH7.4，培养温度30℃，摇瓶震荡培养48h，转速220rpm，发酵上清液具有完全降解赤霉烯酮的能力。本发明提供的微杆菌可应用于玉米等发霉农作物的脱毒。CGMCC NO.1061420150311
【IPC分类】A23K1/00, C12N1/20, A23L1/015, C12R1/01
【公开号】CN104946555
【申请号】CN201510220300
【发明人】吕红, 徐天宇, 周峻岗, 余垚, 胡苏莹
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月4日