一种真菌荧光染色的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及荧光染色的方法，具体涉及一种真菌荧光染色的方法，同时还涉及该方法在观察病原真菌入侵过程中的应用。
【背景技术】
[0002]植物病理学的研宄中经常需要观察病原真菌与寄主植物的相互作用。传统的组织透明染色法可以对组织中病菌菌丝扩展进行定量研宄，揭示寄主和病原物相互作用的时空变化动态。但是，该组织透明染色法的应用具有一定的局限:首先，该法难以区分细胞的病理性坏死和机械创伤，会导致观察结果不理想；其次，对于观察真菌孢子在寄主植物表面的萌发和侵入的过程，该组织透明染色法无法实现。因为组织透明染色法在操作过程当中需要反复漂洗，会将孢子洗脱下来。此外，该组织透明染色法具有操作耗时长、步骤繁琐等缺点。
[0003]观察真菌孢子萌发入侵的过程中另一种经常使用的方法是通过转基因技术将绿色荧光蛋白基因(GFP)转化到病原真菌中，使该基因在病原真菌中表达，然后在荧光显微镜下观察病菌的形态和活动情况。该法能更准确、快速地观察病菌在寄主植物表面和组织中的行为，是研宄病菌与其寄主之间的相互关系较为理想的方法。然而，该法涉及转基因的操作过程，包括表达载体的构建和遗传转化等过程，耗时更长，且对操作者的技术要求较高，还有不少真菌的遗传转化难以成功，无法将绿色荧光蛋白基因在真菌中顺利表达。
[0004]因此，建立一种快速的能够在宿主和病原体之间产生类似绿色荧光蛋白高对比度而不需要遗传转化的染色方法对于观察病原真菌的入侵过程很有意义。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种真菌荧光染色的方法及应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种真菌荧光染色的方法，该方法包括:
寄主植物表面病原真菌孢子入侵寄主叶组织前的染色:直接将染色液均匀喷雾在寄主植物叶片表面，使寄主植物叶片表面形成一层染色液膜，以观察病原真菌孢子的萌发和入侵情况；
病原真菌菌丝侵入寄主叶组织后情况的染色:将病原真菌菌丝侵蚀的叶片浸入沸水浴的脱色液中，直至叶片中的叶绿素完全脱除，此时叶片为苍白色；取出叶片，先用50%体积浓度的乙醇清洗2-3次使脱水的叶细胞恢复原状，每次10-15分钟，然后用50mM氢氧化钠清洗2-3次使叶片变得透明，每次10-15分钟，接着用纯水清洗2-3次，每次10-15分钟，最后将叶片浸入染色液中染色5-8min，以观察病原真菌侵入到寄主叶组织后的情况。
[0007]其中，上述脱色液是95% (v/v)乙醇；
上述染色液是将2mg直接黄96 (Direct Yellow 96)溶于10mL 0.1M的pH值为8.5的Tris - HCl缓冲液中配制而成。
[0008]本文中提及的将叶片侵入脱色液/染色液时，脱色液/染色液以盖住叶片为宜。
[0009]本发明同时还提供上述方法在观察真菌孢子在寄主植物表面的萌发和侵入过程中的应用。
[0010]本发明相与现有技术相比，具有如下优点:
1.安全环保:所用试剂均无毒无害，如95%和50%体积浓度的乙醇、50mM的NaOH都是实验室经常使用的常规试剂，比起常规脱色方法中用到的氯仿、苯酚、三氯乙酸、吡啶等试剂而言更加安全环保；
2.操作方法简单易行:在不影响染色效果的前提下，不仅省略了切片的过程，染色的步骤也大为简化。
【附图说明】
[0011]图1是叶片表面晚疫病菌孢子的萌发和入侵观察图(放大倍数10X40)。
[0012]其中:A-接种后Oh ；B-接种后12h ;C_接种后24h。
[0013]图2是晚疫病菌菌丝入侵后在叶组织内的生长情况观察图(放大倍数10X20)。
[0014]其中:A-接种后48h ；B-接种后72h ;C_接种后96h。
[0015]图3是豇豆煤霉病菌入侵豇豆的观察图。
[0016]其中:A-豇豆煤霉病菌分生孢子入侵叶组织前于叶片表面；B_入侵后。
[0017]图4是前子炭疽病菌入侵前子的观察图。
[0018]其中:A-茄子炭疽病菌分生孢子入侵叶组织前于叶片表面；B_入侵后。
【具体实施方式】
[0019]以下实施例中用到的染色液和脱色液:
染色液是将2mg直接黄96 (Direct Yellow 96)溶于10mL 0.1M的Tris - HCl缓冲液(pH=8.5)中配制而成。
[0020]脱色液是95% (v/v)乙醇。
[0021]实施例1
以马铃薯晚疫病入侵过程为例。
[0022]1.材料
马铃薯品种和晚疫病菌生理小种:供试马铃薯品种为费乌瑞它，马铃薯晚疫病菌来自湖南农业大学。
[0023]2.方法
将供试马铃薯品种块茎播于小花盆中，在16-20°C和日照12-16h的条件下育苗。将幼苗叶片展平后，用浓度约I X 15个/mL的马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液喷雾接种，再将花盆移入人工气候箱培养，培养条件:16-18°C，光照16h，光强不低于ΙΟΟΟΟΙχ，湿度100%。
[0024]对接种后0h、12h、24h、48h、72h、96h的叶片分别进行取样。
[0025]接种后0h、12h、24h的叶片采用直接染色法，即直接将染色液均匀喷雾在叶片表面，然后在配置UV-2A过滤器(激发过滤器，330-380nm ;分色镜，400nm ;屏障过滤器420nm)的荧光显微镜下观察(不要加盖玻片)，可观察到叶片表面孢子的萌发和入侵情况。从图1可以看出晚疫病菌的游动孢子囊12h时开始萌发(见图1B)，到12-24h菌丝开始在叶面上扩展，寻找气孔入侵(见图1C)。
[0026]由于菌丝进入寄主组织后叶片中的叶绿素的存在会影响菌丝的荧光观察，故先进行脱色处理以脱除叶片中的叶绿素，因此，接种后48h、72h、96h的叶片材料需先脱色后再染色，具体过程为:将取样的叶片浸入沸水浴的脱色液中，直至叶片中的叶绿素完全脱除，取出叶片，先用50%体积浓度的乙醇清洗2次，每次15分钟，然后用50mM氢氧化钠清洗2次，每次15分钟，再用纯水清洗3次，每次10分钟，最后将叶片浸入染色液中染色5min。直接取出叶片，用荧光显微镜观察马铃薯晚疫病菌菌丝在寄主植物马铃薯之间的扩展情况。参见图2，为菌丝入侵后在叶组织内的生长情况，接种96h后，叶片组织中的菌丝从气孔中伸出(图2C)。
[0027]实施例2
以豆工豆煤霉病菌(Cercospora vignae)入侵5工豆为例。
[0028]豇豆煤霉病菌来自湖南农业大学植物保护学院实验室。豇豆品种为红嘴燕，购于湖南省农科院蔬菜花丼所。
[0029]对接种豇豆煤霉病菌后0h_5h、72h左右的豇豆叶片分别进行取样。
[0030]接种后0_5h的叶片采用直接染色法，即直接将染色液均匀喷雾在叶片表面，然后在配置UV-2A过滤器(激发过滤器，330-380nm ；分色镜，400nm ；屏障过滤器420nm)的焚光显微镜下观察(不要加盖玻片)豇豆煤霉病菌孢子在豇豆叶片表面的情况，见图3A。
[0031]接种后72h左右的叶片材料先脱色后再染色，具体过程为:将取样的叶片材料浸入沸水浴的脱色液中，直至叶片中的叶绿素完全脱除，取出叶片，先用50%体积浓度的乙醇清洗3次，每次10分钟，然后用50mM氢氧化钠清洗3次，每次10分钟，再用纯水清洗2次，每次15分钟，最后将叶片浸入染色液中染色8min。直接取出叶片，用荧光显微镜观察豇豆煤霉病菌菌丝在寄主植物豇豆叶组织内的情况，见图3B。
[0032]实施例3
以前子炭疽病菌(Colletotrichum truncaturn)入侵前子为例。
[0033]茄子炭疽病菌来自湖南农业大学植物保护学院实验室。茄子品种为黑冠早茄，购于湖南省农科院蔬菜花丼所。
[0034]对接种茄子炭疽病菌后0h_5h、72h左右的茄子叶片分别进行取样。
[0035]染色方法同实施例2，荧光显微镜下观察茄子炭疽病菌孢子在茄子叶片表面(图4A)和茄子炭疽病菌菌丝在茄子叶组织内(图4B)的情况。
【主权项】
1.一种真菌荧光染色的方法，其特征在于，该方法包括: 寄主植物表面病原真菌孢子入侵寄主叶组织前的染色:将染色液均匀喷雾在有病原真菌侵蚀的寄主植物叶片表面； 病原真菌菌丝侵入寄主叶组织后的染色:将病原真菌菌丝侵蚀的叶片浸入沸水浴的脱色液中，直至叶片中的叶绿素完全脱除；取出叶片，用50%体积浓度的乙醇清洗2-3次，每次10-15分钟，然后用50mM氢氧化钠清洗2_3次，每次10-15分钟，接着用纯水清洗2_3次，每次10-15分钟，最后将叶片浸入染色液中染色5-8min ； 上述脱色液是95%体积浓度的乙醇； 上述染色液是将2mg直接黄96溶于10mL 0.1M的pH值为8.5的Tris - HCl缓冲液中配制而成。2.权利要求1所述方法在观察真菌孢子在寄主植物表面的萌发和侵入过程中的应用。
【专利摘要】一种真菌荧光染色的方法，该方法包括直接将染色液（将直接黄96溶于0.1M的Tris–HCl缓冲液（pH=8.5）中）均匀喷雾在寄主植物叶片表面，以观察病原真菌孢子于寄主植物叶片表面的情况；还包括将病原真菌菌丝侵蚀的叶片浸入沸水浴的95%体积浓度的乙醇中以完全脱除叶绿素；取出叶片，依次用50%体积浓度的乙醇、50mM氢氧化钠、纯水清洗，最后将叶片浸入染色液中染色，以观察病原真菌侵入到寄主叶组织后的情况。如此，由于本方法所用试剂均无毒无害，比起常规脱色方法中用到的氯仿、苯酚、三氯乙酸、吡啶等试剂而言更加安全环保；且本操作方法简单易行，在不影响染色效果的前提下，不仅省略了切片的过程，染色的步骤也大为简化。
【IPC分类】C12Q1/02, G01N1/30
【公开号】CN104894211
【申请号】CN201510361764
【发明人】周倩, 刘甜甜, 熊兴耀
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日