一种分枝型mPEG的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学和蛋白质化学领域，特别涉及一种分枝型mPEG的制备方法。 技术背景
[0002] 近年来，越来越多的蛋白质，酶被应用于临床治疗，然而这些生物大分子具有如不 易吸收、体内降解、引起免疫反应等的缺点，不能直接作为药物使用，但是经过聚乙二醇修 饰的生物大分子弥补这些缺点，而且，聚乙二醇具有良好的生物相容性，对人体无毒，所以 用其修饰蛋白质是当今新药研发的热门领域。例如，PEG-腺苷脱氨酶已获FDA批准上市； PEG修饰的细胞因子已被制成，并且PEG修饰的GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子）显示了两 种不相关联的生物学性质。
[0003] 分枝型mPEG的合成，目的是为了解决直连PEG-活性分子的活性降低的问题，在修 饰度相同的情况下，前者连接的PEG分子量会成倍增加，其一是扩大结合物分子的大小，延 长体内保留时间，其二是更加有效的避免被水解和引发免疫反应，所以，在有相同修饰度的 情况下，分支型PEG的修饰效果比直链PEG好很多。
[0004] 目前为止，分枝型PEG的合成方法有以下几种：
[0005] 1.以mPEG-OH为起始原料，合成路线为：
[0007] 本路线缺陷在于成本高，有大量废液产生；
[0008] 2.以mPEG-CHO为起始原料，合成路线为：
[0009]
[0010] 本路线缺陷在于产率很低，且难以纯化；
[0011] 3.以mPEG-COOH为起始原料，合成路线为：
[0012]
[0013] 本路线缺陷在于反应条件难以控制，成本较高；
[0014] 上述合成路线的各种缺陷使得分枝型聚乙二醇价格昂贵，限制了其在科研和临床 上的应用。
【发明内容】
[0015] 本发明公开了一种分枝型聚乙二醇的制备方法，目的是为了克服上述分枝型聚乙 二醇的各种缺陷。
[0016] 本发明公开的分枝型mPEG在结构上是两个mPEG-COOH对鸟氨酸的缩合产物，具有 如下分子结构：
[0017]
[0018] 其合成步骤如下：
[0019] (1)制备羧甲基化的mPEG
[0020] 将mPEG溶于二氯甲烷中，滴加琼斯试剂，室温搅拌过夜，加水萃取，分液，收集有 机相，浓缩，得到羧甲基化的mPEG ;
[0021] (2)制备鸟氨酸乙酯盐酸盐
[0022] 将鸟氨酸盐酸盐溶于无水乙醇，滴加氯化亚砜，室温搅拌过夜，浓缩除去剩余的氯 化亚砜和溶剂，得到鸟氨酸乙酯盐酸盐；
[0023] (3)制备分枝型mPEG
[0024] 将羧甲基化的mPEG和鸟氨酸乙酯盐酸盐加入到二氯甲烷中，加入三乙胺，DCC， 氮-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌过夜，过滤，滤液倒入乙醚中，得到白色沉淀，过滤，把滤饼 加入到2N NaOH水溶液中，室温搅拌2小时，加入浓盐酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2 遍，合并有机相，干燥，浓缩，得到粗产品，再用乙醇重结晶，得到白色分枝型mPEG。
[0025] 所述的氨基酸为鸟氨酸，所述的mPEG为相对分子量为600-20000之间的聚合物。
[0026] 本发明的方法制备的分枝型mPEG可用于修饰蛋白质等生物大分子，也可以修饰 小分子药物。
[0027] 本发明具有以下特点：
[0028] 1、发明利用多肽合成原理，但只需保护鸟氨酸的羧基，无需保护氨基或者活化羧 基；
[0029] 2、反应条件温和，操作简单；
[0030] 3、所用原料和试剂便宜易得；
[0031] 4、总收率高，可达78%。
【附图说明】
[0032] 图1是分枝型mPEG的合成路线图。
[0033] 下面通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本
【发明内容】
作进一 步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改 进，仍属于本发明的保护范围之内。
[0034] 具体实施例方式
[0035] 实施例1，用本发明的方法制备一种分枝型mPEG，其步骤为：
[0036] 1、制备羧甲基化的mPEG
[0037] 将100g mPEG600溶于I. 5L二氯甲烷中，滴加琼斯试剂，室温搅拌过夜，加水萃取， 分液，收集有机相，浓缩，加入石油醚搅拌，析出固体，过滤得到为92g的mPEG600-C00H ;
[0038] 2、制备鸟氨酸乙酯盐酸盐
[0039] 将100g鸟氨酸盐酸盐溶于2. IL无水乙醇，滴加119g氯化亚砜，室温搅拌过夜，浓 缩除去剩余的氯化亚砜和溶剂，得到l〇2g鸟氨酸乙酯盐酸盐；
[0040] 3、制备分枝型mPEG
[0041] 取步骤1所得到的mPEG600-C00H 80g和步骤2所得到的鸟氨酸乙酯盐酸盐9g加 入到500ml二氯甲烷中，加入6g三乙胺，7g DCC，IOg氮-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌过夜， 过滤，滤液倒入乙醚中，得到白色沉淀，过滤，把滤饼加入到2N NaOH水溶液中，室温搅拌2 小时，加入浓盐酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有机相，干燥，浓缩，得到粗产 品，再用乙醇重结晶，得到62g白色分枝型mPEG。
[0042] 实施例2,用本发明的方法制备一种分枝型mPEG，其步骤为：
[0043] 1、制备羧甲基化的mPEG
[0044] 将100g mPEG5000溶于I. 5L二氯甲烷中，滴加琼斯试剂，室温搅拌过夜， 加水萃取，分液，收集有机相，浓缩，加入石油醚搅拌，析出固体，过滤得到为90g的 mPEG5000-C00H ；
[0045] 2、制备鸟氨酸乙酯盐酸盐
[0046] 将100g鸟氨酸盐酸盐溶于2. IL无水乙醇，滴加119g氯化亚砜，室温搅拌过夜，浓 缩除去剩余的氯化亚砜和溶剂，得到IOlg鸟氨酸乙酯盐酸盐；
[0047] 3、制备分枝型mPEG
[0048] 取步骤1所得到的mPEG5000-C00H 80g和步骤2所得到的鸟氨酸乙酯盐酸盐7g 加入到500ml二氯甲烷中，加入6g三乙胺，7g DCC，IOg氮-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌过 夜，过滤，滤液倒入乙醚中，得到白色沉淀，过滤，把滤饼加入到2N NaOH水溶液中，室温搅拌 2小时，加入浓盐酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有机相，干燥，浓缩，得到粗产 品，再用乙醇重结晶，得到58g白色分枝型mPEG。
[0049] 实施例3,用本发明的方法制备一种分枝型mPEG，其步骤为：
[0050] 1、制备羧甲基化的mPEG
[0051] 将100g mPEG 10000溶于I. 8L二氯甲烷中，滴加琼斯试剂，室温搅拌过夜， 加水萃取，分液，收集有机相，浓缩，加入石油醚搅拌，析出固体，过滤得到为93g的 mPEG10000-C00H ；
[0052] 2、制备鸟氨酸乙酯盐酸盐
[0053] 将100g鸟氨酸盐酸盐溶于2. IL无水乙醇，滴加119g氯化亚砜，室温搅拌过夜，浓 缩除去剩余的氯化亚砜和溶剂，得到99g鸟氨酸乙酯盐酸盐；
[0054] 3、制备分枝型mPEG
[0055] 取步骤1所得到的mPEG10000-C00H 80g和步骤2所得到的鸟氨酸乙酯盐酸盐4g 加入到500ml二氯甲烷中，加入4g三乙胺，5g DCC，6g氮-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌过夜， 过滤，滤液倒入乙醚中，得到白色沉淀，过滤，把滤饼加入到2N NaOH水溶液中，室温搅拌2 小时，加入浓盐酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有机相，干燥，浓缩，得到粗产 品，再用乙醇重结晶，得到59g白色分枝型mPEG。
[0056] 实施例4,用本发明的方法制备一种分枝型mPEG，其步骤为：
[0057] 1、制备羧甲基化的mPEG
[0058] 将100g mPEG 20000溶于I. 8L二氯甲烷中，滴加琼斯试剂，室温搅拌过夜， 加水萃取，分液，收集有机相，浓缩，加入石油醚搅拌，析出固体，过滤得到为86g的 mPEG10000-C00H ；
[0059] 2、制备鸟氨酸乙酯盐酸盐
[0060] 将100g鸟氨酸盐酸盐溶于2. IL无水乙醇，滴加119g氯化亚砜，室温搅拌过夜，浓 缩除去剩余的氯化亚砜和溶剂，得到97g鸟氨酸乙酯盐酸盐；
[0061] 3、制备分枝型mPEG
[0062] 取步骤1所得到的mPEG20000-C00H 80g和步骤2所得到的鸟氨酸乙酯盐酸盐3g 加入到500ml二氯甲烷中，加入3g三乙胺，4g DCC，4g氮-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌过夜， 过滤，滤液倒入乙醚中，得到白色沉淀，过滤，把滤饼加入到2N NaOH水溶液中，室温搅拌2 小时，加入浓盐酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有机相，干燥，浓缩，得到粗产 品，再用乙醇重结晶，得到59g白色分枝型mPEG。
【主权项】
1. 一种分枝型mPEG的制备方法，其工艺步骤如下： (1) 制备羧甲基化的mPEG 将mPEG溶于二氯甲烷中，滴加琼斯试剂，室温搅拌过夜，加水萃取，分液，收集有机相， 浓缩，得到羧甲基化的mPEG; (2) 制备鸟氨酸乙酯盐酸盐 将鸟氨酸盐酸盐溶于无水乙醇，滴加氯化亚砜，室温搅拌过夜，浓缩除去剩余的氯化亚 砜和溶剂，得到鸟氨酸乙酯盐酸盐； (3) 制备分枝型mPEG 将羧甲基化的mPEG和鸟氨酸乙酯盐酸盐加入到二氯甲烷中，加入三乙胺，DCC，氮-羟 基琥珀酰亚胺，室温搅拌过夜，过滤，滤液倒入乙醚中，得到白色沉淀，过滤，把滤饼加入到 2NNaOH水溶液中，室温搅拌2小时，加入浓盐酸至pH= 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并 有机相，干燥，浓缩，得到粗产品，再用乙醇重结晶，得到白色分枝型mPEG。2. 按权利要求1所述的分枝型聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述的氨基酸为鸟 氨酸。3. 按权利要求1所述的分枝型聚乙二醇的制备方法，其特征在于，所述的mPEG为相对 分子量为600-20000之间的聚合物。
【专利摘要】本发明公开了一种分枝型mPEG的制备方法，先分别以单甲氧基聚乙二醇为原料制备羧甲基化的mPEG和鸟氨酸盐酸盐为原料制备鸟氨酸乙酯盐酸盐，然后以两者为原料经过缩合、水解反应，得到分枝型mPEG，既可修饰小分子药物，也可以修饰大分子蛋白质，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】C08G65/48
【公开号】CN104892927
【申请号】CN201510253373
【发明人】不公告发明人
【申请人】湖南华腾制药有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日