一种鲤鱼巨噬细胞噬菌能力的定量检测方法

文档序号:8554555阅读:506来源:国知局
一种鲤鱼巨噬细胞噬菌能力的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明是一种涉及生物工程技术领域的细胞吞噬活性的检测方法。
【背景技术】
[0002] 巨噬细胞属免疫细胞,位于组织内,源自单核细胞,是机体内的"清道夫",会去除 体内那些坏掉死去的细胞以及其他废料。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式 对细胞残片及病原体进行吞噬以及消化作用,并激活淋巴球或其他免疫细胞,令其对病原 体做出反应,阻止其扩散和生长。巨噬细胞在脊椎动物体内,可以同时参与非特异性免疫 (先天性免疫)和特异性免疫(获得性免疫)。尤其对于鲤鱼这类较低等的脊椎动物,因为 不具备像人类及其他哺乳动物那样完善的免疫系统和免疫机制,巨噬细胞在免疫应答过程 中发挥极其重要的作用。
[0003] 巨噬细胞具有很强的吞噬作用。它们可以将外界病原体例如细菌等通过小泡的形 式吞食进入细胞内部,形成吞噬体,与溶酶体相融合逐渐降解病原体,以达到抵御外界病原 体侵害的作用,发挥重要的免疫功能。同时,它们还可以将自身凋亡的细胞及其一些细胞碎 片进行吞噬和自我消化,清除机体的垃圾,以防不断积累的凋亡细胞会导致自身免疫的紊 乱,达到维持机体免疫平衡的作用。同时,鲤鱼是非常常见的淡水鱼种,极易获得,而巨噬细 胞的提取方法简单,且便于培养,并可进行纯化。因此,应用鲤鱼巨噬细胞研宄细胞吞噬活 性是非常合适和简便的。
[0004] 本发明中提供一种鲤鱼巨噬细胞吞菌活性定量的检测方法,以成像的方法直接的 表现巨噬细胞的吞噬活性,更通过计数对吞菌活性进行量化,实现了巨噬细胞吞噬活性的 定量,为今后细胞免疫学,分子免疫学和环境毒理学实验奠定了基础。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种鲤鱼巨噬细胞噬菌能力定量的检测方法,即无菌提取鲤 鱼原代巨噬细胞后,用无双抗Hank' s平衡盐溶液洗去细胞中含有的双抗和培养基,以细胞 和细菌1:10的密度和细菌共同孵育1.5 h,250 X g,4° C离心5分钟移除上清,用载玻片 离心机将细胞固定在载玻片上,染色,镜检和计数,实现对巨噬细胞的噬菌能力的定量。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的: Hank' s平衡盐工作液(HBSS) :93. 9% Hank' s平衡盐溶液,5%新鲜鲤鱼血清,1% 0. 01 M H印es缓冲液(羟乙基哌嗪乙硫磺酸),0.1% lOU/ml H印arin (肝素钠)储液。
[0007] 新鲜鲤鱼血清:用来提取原代巨噬细胞的鲤鱼,麻醉消毒后尾静脉取血,血液在室 温下凝固2小时(不加抗凝剂)后血清自然析出,3000转/分,4 °C离心10分钟,取上清, 分离出血清。
[0008] 本发明一种鲤鱼巨噬细胞噬菌能力定量检测方法,其特征在于包括以下步: a.选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼实验室条件预养2周,无菌条 件下percoll法分离鲤鱼原代巨噬细胞得到细胞悬液,用无双抗HBSS工作液洗涤细胞3次 后将细胞调整为浓度2. 5 X IO7个/mL ; b. 与此同时,将活化和培养的细菌也用HBSS工作液洗涤并调整为2. 5 X IO8个/mL。 取0.1 mL细菌悬液加入0.1 mL细胞悬液中(细胞个数:细菌个数=1:10),继续加入0.8 mL 无双抗HBSS溶液于2 mL的离心管中。在26 ° C下,将离心管置于旋转混匀仪上使细胞和 细菌共孵I. 5 h,保证细胞充分接触细菌; c. 孵育后,使用最适离心力250 X g,4 ° C离心5分钟洗涤未被吞噬的细菌3次,用 0. 5 mL HBSS工作液重悬细胞。取0.2 mL细胞悬液,使用载玻片离心机将细胞固定在载玻 片上; d. 用Diff-Quik染色试剂盒对载玻片进行染色后,封片,用100X显微镜油镜观察细 胞吞噬细菌的情况。并对胞内细菌个数进行计数,量化细胞吞噬细菌的个数。
[0009] 在以上实验步骤中,所述的无双抗HBSS工作液的组分配方为:93. 9% Hank' s平 衡盐溶液,5%新鲜鲤鱼血清,1% 0. 01 M H印es缓冲液(羟乙基哌嗪乙硫磺酸),0. 1% lOU/ml Heparin (肝素钠)储液。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明三种离心力200 g,250 g,300 g对洗除胞外细菌效果的影响 图2为本发明原代鲤鱼巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌显微镜成像图。
[0011] 图3为本发明原代鲤鱼巨噬细胞吞噬大肠杆菌显微镜成像图。
[0012] 图4为本发明原代鲤鱼巨噬细胞吞噬副溶血弧菌显微镜成像图。
[0013] 图5为本发明原代鲤鱼巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌,大肠杆菌和副溶血弧菌的 吞嗤指数。
[0014] 本发明的目的是提供一种鲤鱼巨噬细胞噬菌能力定量的检测方法,即无菌提取鲤 鱼原代巨噬细胞后,用无双抗Hank' s平衡盐溶液洗去细胞中含有的双抗和培养基,以细胞 和细菌1:10的密度和细菌共同孵育1.5 h,250 X g,4° C离心5分钟移除上清,用载玻片 离心机将细胞固定在载玻片上,染色,镜检和计数,实现对巨噬细胞的噬菌能力的定量。
[0015] 本发明相比较其他已报道的方法,是有以下优点:1,实现巨噬细胞在体外条件下 吞噬存活的细胞,使用的Hank's平衡盐工作液(HBSS)可以实现细胞和细菌共存活状态;2, 鲤鱼巨噬细胞极易获得,有充足的实验材料,既可以通过图片方式直接展示细菌吞菌能力 的状态,也可以通过对细胞内吞噬细菌多少的计数量化巨噬细胞吞菌能力。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术为前提下进行实施。
[0017] 实施例本实施例为鲤鱼原代巨噬细胞对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,副溶血弧菌 三种细菌吞噬能力的检测,其步奏如下所述: 1,选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周,饲养条件为,水温25 土 Γ C,光照周期为光照:黑暗=14h:10h,每天两次喂食丰年虾。按percoll法无菌分 离鲤鱼原代巨噬细胞,得到巨噬细胞悬液,用HBSS溶液300 X g离心5分钟洗涤细胞,洗 去细胞悬液中的培养基和双抗,经血小球计数板对细胞悬液进行计数后,用HBSS溶液将细 胞调整为浓度2. 5 X IO7个/mL。
[0018] 2,同时,金黄色葡萄球菌(5?<3/成r/ococciAs aareiAs),大肠杆菌( coJ7),副溶血弧菌(KiArio /^araAaeffiO^Fiicw1S)经过活化后,用HBSS溶液洗绦细菌3次后 洗除细菌悬液中的培养液,并根据0D600的值计算细菌的浓度,并用HBSS溶液调整细菌浓 度为 2. 5 X IO8 个 /mL。
[0019] 3,取0.1 mL细胞悬液分别和0.1 mL金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,副溶血弧菌悬液 共同加入2 mL离心管中,使得细胞个数:细菌个数为1:10。继续将50 μ L新鲜鲤鱼血清 和750 μ L HBSS溶液加入离心管中。将离心管置于旋转混匀仪上使细胞和细菌在26 ° C 共孵1.5 h,保证细胞能充分接触到细菌。孵育后,使用离心的方式洗涤未被巨噬细胞吞噬 的胞外细菌,在既要保证能得到巨噬细胞,又要去除细菌的条件下,经过对三种离心力200 X g,250 X g,300 X g的试验,证明用250 X g离心能收集到细胞的数量多而胞外细 菌数量少,达到洗涤胞外细菌保留巨噬细胞的目的(图1)。离心3次后,用0. 5 mL HBSS溶 液将细胞重悬。分别取〇. 2 mL吞噬三种细菌的巨噬细胞悬液,使用载玻片离心机离心650 rpm,5 min将细胞固定在载玻片上。最后用Diff-Quik染色试剂盒对载玻片进行染色,用树 胶和盖玻片进行封片,有利于长期保存。
[0020] 4,镜检:用100 X显微镜油镜镜检载玻片,分别观察巨噬细胞对金黄色葡萄球菌 (图2),大肠杆菌(图3),副溶血弧菌(图4)的吞噬情况。
[0021] 5,计数:随机选择至少200个镜检的巨噬细胞,对吞有至少一个细菌的巨噬细胞 和胞内吞噬的细菌的数量进行分别计数。运用公式进行计数:
【主权项】
1. 一种鲤鱼巨噬细胞噬菌能力定量检测方法,其特征在于包括以下步骤: a. 选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼实验室条件预养2周,无菌条 件下percoll法分离鲤鱼原代巨噬细胞得到细胞悬液,用无双抗HBSS工作液洗涤细胞3次 后将细胞调整为浓度2. 5 X IO7个/mL ; b. 与此同时,将活化和培养的细菌也用HBSS工作液洗涤并调整为2. 5 X IO8个/mL, 取0.1 mL细菌悬液加入0.1 mL细胞悬液中(细胞个数:细菌个数=1:10),继续加入0.8 mL 无双抗HBSS溶液于2 mL的离心管中,在26 ° C下,将离心管置于旋转混匀仪上使细胞和 细菌共孵I. 5 h,保证细胞充分接触细菌; c. 孵育后,使用离心力250 X g,4 ° C离心5分钟,洗涤未被吞噬的细菌3次(洗涤 细胞3次以去除胞外细菌),用0. 5 mL HBSS工作液重新悬浮细胞;取0. 2 mL细胞液,使用 载玻片离心机将细胞固定在载玻片上; d. 用Diff-Quik染色试剂盒对载玻片进行染色后,封片,用100X显微镜油镜观察细 胞吞噬细菌的情况,并对胞内细菌个数进行计数,量化细胞吞噬细菌的个数。
2. 根据权利要求1所述的一种鲤鱼巨噬细胞噬菌能力定量检测方法,其特征在于所述 的无双抗HBSS工作液的组分配方为:93. 9% Hank's平衡盐溶液,5%新鲜鲤鱼血清,1% 0.01 M H印es缓冲液(羟乙基哌嗪乙硫磺酸),0.1% lOU/ml H印arin (肝素钠)储液。
【专利摘要】本发明提供一种生物工程技术领域的鲤鱼巨噬细胞噬菌能力定量检测方法。选鲤鱼原代巨噬细胞为实验材料,用无双抗Hank’s平衡盐工作液洗去细胞中含有的双抗和培养基,以细胞和活的细菌1:10的密度和细菌共同孵育1.5h,250×g,4°C离心5分钟移除上清,用载玻片离心机将细胞固定在载玻片上,最后对载玻片上的细胞进行染色,镜检和计数,实现对巨噬细胞的噬菌能力的定量。本发明实现在体外条件下,巨噬细胞吞噬活菌,更加模拟自然机体抵抗存活细菌的状态。同时实验结果以图片和数据两种方式展现出来,既可以清晰的看到细菌被鲤鱼原代巨噬细胞吞噬在细胞内,又可以将巨噬细胞的吞噬能力进行量化,更有利于评价巨噬细胞的吞噬能力,为接下来细胞学,分子生物学的实验开展奠定了基础。
【IPC分类】C12Q1-02
【公开号】CN104878067
【申请号】CN201510336074
【发明人】杨明, 裘文慧, 胡磊, 刘帅, 吴明红
【申请人】上海大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月17日
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