类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种类芽孢杆菌YN2)新菌种及其培养方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 以形态学为分类基础，早期研宄将类芽孢杆菌归入芽孢杆菌属。自1993年，Ash 等人提出从芽孢杆菌中分出11个种，另立类芽孢菌属之后，至今已有165个种，4个亚种 (http://www. bacterio. cict. fr/p/paenibacillus. html)。模式种为多粘类芽抱杆菌 ATCC 842τ。类芽孢菌属的分离源十分广泛，分离自根际土壤、空 气、水体和食品等环境。1996年，由Heyndrickx等对类芽孢菌属的相关特性做了修正。好 氧或兼性厌氧生长，产芽孢，细胞呈杆状，革兰氏阳性细胞壁，以周生鞭毛运动，中温，主要 的脂肪酸为反异式饱和脂肪酸C 15:(l。类芽孢菌属G+C含量范围为39~59 mol%。
[0003] 多相分类的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信 息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研宄微生物分类和系统进化的过 程。其中DNA同源性分析是确定正确的分类地位的最直接的方法，而DNA-DNA杂交可以在 总体水平上研宄微生物间的关系，用于种水平上的分类学研宄。1987年，国际系统细菌学委 员会（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB)规定，DNA 同源性 多70%为细菌种的界限。
[0004] 类芽孢菌属的很多微生物可产生多种生物活性物质，如酶和抗菌物质等，作为重 要的植物生防细菌和植物根际促生菌在农业领域已得到广泛应用。类芽孢杆菌是具有较 强抗逆能力的细菌，可产生高活性的絮凝物质、可降解微囊藻产生的微囊藻毒素，降解油脂 等，在黄静污染治理方面也具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种类芽孢杆菌属的新菌种。
[0006] 本发明的目的之二在于提供该新菌种的培养方法。
[0007] 为实现上述的目的，本发明采用如下技术方案： 一种类芽孢杆菌，该菌株的保藏号为CGMCC No. 10529。
[0008] -种培养上述的类芽孢杆菌的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将类芽孢 杆菌接种于培养基中，在20-50°C，pH 5. 0-12. 0的条件下进行培养。
[0009] 上述的培养温度为37 °C。
[0010] 上述的 pH 为 7. 0-8.0。
[0011] 上述的培养基中还有质量百分比不超过7%的NaCl。
[0012] 上述的培养在需氧条件下进行。
[0013] 上述的类芽孢杆菌在液体发酵法生产葡萄糖醛酸酶和半乳糖苷酶中的应用 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0014] 本发明的积极进步效果在于：本发明提供了类芽孢菌属的一个新种，该菌株的分 类地位是知CiBMSP.，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为 sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物 资源，对我们以后更好地利用类芽孢菌做出了一定的贡献。本发明的类芽孢菌YN2,可提取 酯酶和蛋白酶，在食品、医药和化工等行业具有有广泛应用。
[0015] 牛物材料保藏信息 本发明的类芽孢菌YN2,已于2015年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研宄所，邮编：1〇〇1〇1。该菌株的保藏编号为：CGMCCNo. 10529。该菌株的分类命名是类 芽抱菌 ，名称为 YN2〇
【附图说明】
[0016] 图1显示本发明类芽孢菌新种菌株YN2的16S rRNA系统发育进化树。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0018] 18268τ 和 rigwi JCM 16352τ购自 日本微生物菌种保藏中心。
[0019] 实施例1、本发明新菌株ΥΝ2的分离制备 取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，30°C培养2-3天，挑取单菌落， 然后划线纯化得到。
[0020] 将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，其保藏编 号为 CGMCC No. 9738。
[0021] 实施例2、本发明新菌株YN2的表观特征 1.菌落特征 取菌株YN2的单菌落，转接到LB固体培养基(琼脂)上，于30°C恒温培养箱中培养24h、 36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显 示，菌株YN2在LB固体培养基上形成边缘整齐，微凸起，光滑，不透明，白色的菌落，直径约 2_3mm 〇
[0022] 2.细胞形态学特征 菌株YN2细胞为革兰氏阳性杆菌，顶端圆钝，周生鞭毛；细胞菌体大小为0. 9-1. 1 μηιΧ2·6-4·7 μπι，单生。
[0023] 实施例3、本发明新菌株ΥΝ2的生长特性 挑取在TYA固体培养基(琼脂)上培养24 h的新鲜培养物，接种到TYB液体培养基，37°C 摇床培养20~24h，作为种子。
[0024] 液体TYB培养基的组成（/L):胰蛋白胨15g，NaCl 5g，大豆蛋白胨5g，蒸馏水定容 至 1000 ml0
[0025] L生长温度： 将所培养的YN2种子按2%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种TYB (液体培养基中，混 匀。分别置于 4°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、37°C、40°C、45°C、50°C和 60°C 的水浴培养， 每个温度梯度做三个平行，分别在24 h和48 h时测定其生长情况。得到菌株YN2生长温 度范围为20~50°C，最适温度37°C。
[0026] 2.生长NaCl耐受性 所培养的YN2种子按2%(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0. 0%、2. 0%、 5.0%、7.0%、9%、10.0%、11.0%和12.0%的了￥8培养基，37°〇培养，分别于24 11和48 11的 生长状态做记录。结果显示菌株YN2的NaCl耐受性为7%。
[0027] 3.生长pH范围 用无菌的lmol/L HCl和lmol/L NaOH将灭好菌的TYB培养基调至pH值分别为3. 0、 4· 0、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、8· 0、8· 5、9· 0、10· 0、11· 0、12· 0、13· 0,将所培养的 YN2 种子按 2%接种量接入，30°C培养，分别于24 h和48 h的生长状态做记录。得到菌株YN2生长的 pH 范围为 5. 0~12· 0,最适 pH 为 7. 0~8· 0。
[0028] 实施例4、本发明新菌株YN2的生理生化特性 利用API ZYM和API20E鉴定系统（生产厂商：bioM6rieux)及常规的生理生化测定方 法(东秀珠，蔡妙英等，2001)对菌株YN2及相关的同属菌株进行生理生化特征鉴定。
[0029] 其中API ZYM是一个半定量的微量方法系统，专为研宄酶活所设计的。该技术对 各种标本（组织、细胞、生物体液、洗涤水、土、油，等）都适用。它可系统和快速地研宄19 种酶的活性。用样量极少。实验步骤如下： 1)样品准备：在最小体积稀释标本：可用2 ml无菌蒸馏水或其它如普通的生理盐水不 需要缓冲液。制备一个菌悬液，其混浊度在McFarland No 5和No 6之间。从斜面或离心 肉汤培养物的纯菌种都能用来制备菌悬液。
[0030] 2)试验条的准备：准备一个培养盘和盖子。记标本号于盘的侧面。可使用一个塑 料洗瓶，分装约5ml蒸馏水于培养盘内，为了培养时能保持一定的湿度。从密封的包装中取 出API ZYM试验条，置培养盘内。
[0031] 3)试验条的接种：用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本（65μ1)。
[0032] 4)试验条培养：接种后，托盘上放塑料盖子，37°C培养4小时。所有的测定条件 (时间、温度、培养基、悬液浓度）要保持一致。接种的试验条避光保存。
[0033] 5)试验条的结果观察：培养后，加1滴ZYM A试剂和1滴ZYM B试剂。5分钟后生 色，如果是阳性，将试验条置于一个强光源（1000瓦灯泡）下10秒，把灯泡放在杯上4秒。 这是为消除杯中多余坚牢兰的黄色。暴光后阴性反应变为无色。再置试验条于日光下几分 钟后，就可产生比较的结果。
[0034] 6)记录反应：0_5标记相应的颜色深度。0相当于阴性反应，5为最强反应。2-4 是二者之间的强度。从颜色深度可知近似的微毫克分子浓度（nM) :1相当释放5微毫克分 子浓度（5 nM)，2相当于10 nM，3为20nM，4为30nM，5为40nM或更高。
【主权项】
1. 一种类芽孢杆菌，该菌株的保藏号为CGMCC No. 10529。
2. -种培养根据权利要求1所述的类芽孢杆菌的方法，其特征在于该方法的具体步骤 为：将类芽孢杆菌接种于培养基中，在20-50°C，pH 5. 0-12. 0的条件下进行培养。
3. 根据权利2所述的培养方法，其特征在于所述的培养温度为37°C。
4. 根据权利2所述的培养方法，其特征在于所述的pH为7. 0-8. 0。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养基中还有质量百分比不超过 7% 的 NaCl。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养在需氧条件下进行。
7. 根据权利要求1所述的类芽孢杆菌在液体发酵法生产e -葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷 酶和e-葡萄糖苷酶中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种类芽孢杆菌（Paenibacillussp.YN2）新菌种及其培养方法和应用。发明所提供的类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）分离自陈熟普洱茶，保藏号为CGMCC No.10529。依据多相分类学方法，该菌株是气微菌属的一个新种，其分类地位是Paenibacillus sp.，依据国际细菌系统分类委员会的命名方法，将该种命名为Aeromicrobium yunnanensisi sp.nov.。本发明所提供的气微菌新菌种中温生长（37℃），易培养。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源。本发明所提供的类芽孢杆菌新菌种具有β-葡萄糖醛酸苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，为β-葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶在工业、食品、医药和农业等行业应用提供菌种资源。CGMCC No.1052920150410
【IPC分类】C12N9-24, C12N1-20, C12R1-01
【公开号】CN104877942
【申请号】CN201510315247
【发明人】牛莉莉, 华子义, 唐天羿, 陈媛媛, 熊梦洁, 董文凯
【申请人】上海大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月11日