基于lamp实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法及其引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵 囊检测方法及其引物，是一种利用环介导等温扩增技术结合荧光定量PCR仪，进行粪便中 猪等孢球虫卵囊快速检测的方法。
【背景技术】
[0002] 猪球虫病主要是由寄生于空肠与回肠的猪等孢球虫（Isospora suis)引起，三周 龄以内的哺乳仔猪感染后可出现腹泻和体重下降等临床症状。母猪对猪球虫病的传播影响 不大，临床中很少检测到球虫卵囊，被猪等孢球虫卵囊污染的产房是一代仔猪传给下一代 仔猪的主要途径。猪场环境、临床用药、管理水平与猪球虫病显著相关，非特异性免疫系统 对抗球虫病有重要作用。在试验条件下，100%的相对湿度和25°C气温是等孢球虫卵囊发育 和存活的最佳条件。自然条件下，猪等孢球虫卵囊在体外完成孢子化过程，孢子化的卵囊具 有感染宿主的能力，常给养殖户的经济利益带来巨大的损害。近几年来，随着猪场规模的不 断扩大和养殖管理水平的不断提高，人们越来越重视对仔猪球虫病的预防和治疗。
[0003] 常见的检测猪等孢球虫的方法是采用传统显微镜检测粪便中的卵囊，但是，由 于球虫个体微小，粪便中杂质较多，给检测带来一定的困难。除了显微镜检测外，目前还 有ELISA检测法、自体荧光显微镜检测技术、PCR技术以及基于PCR原理的巢式PCR和 PCR-RFLP等方法。这些方法与传统的显微镜检查方法相比，检测结果较为准确，但操作步骤 繁多，检测时间耗时较长，检测的敏感性也存在不足。
[0004] 环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,英文缩写 LAMP)与普通PCR相比，其优势在于恒温即可进行核酸扩增，不需要经过热循环的温度变 化。LAMP技术和PCR技术在反应温度、反应时间、产物量、引物特异性、引物级别、聚合酶类 型、检测方法、检测成本等方面均有差异，PCR方法检测成本较低，但敏感性和特异性也低于 LAMP技术，具体差异如下表：
[0005] LAMP技术与PCR技术的比较
[0006]
【主权项】
1. 检测猪等孢球虫卵囊的引物，其特征在于：所述引物如下： 上游外引物 F3 :5' -ATAGGATCAGGACCTCGTG-3' ； 下游外引物 B3 :5' -GGCAITCCTCGITGAAGAT-3' ； 上游内引物FIP(Flc-F2): 5'-CGTGCAGCCCAGAACATCTGTGTCTAACGCAAGGAAGT-3' ； 下游内引物BIP(Blc-B2): 5'-ACACTGATGCATCCAACGAGTTTCACGATGCATACTCACAAG-3' ； 上游环引物 LoopF :5' -TCACAGACCTGTTAITGCCTC-3' ； 下游环引物 LoopB :5' -TGGCCGATAGGTCTAGGTAAT-3'。
2. 采用权利要求1所述的引物基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法，其特 征在于：其包括以下步骤 1) 猪等孢球虫卵囊的收集与纯化 采集新鲜的仔猪粪样，用饱和盐水漂浮法对卵囊进行收集，采用Sheather氏蔗糖溶 液梯度离心法对收集的卵囊进行纯化，具体操作方法是：取含猪等孢球虫卵囊的粪便溶于 9-10倍体积水中，依次经80目和120目筛过滤后，然后2000-2500rpm离心2-3min，弃上清， 加入沉淀9-10倍体积的饱和盐水，3000-3500rpm离心2-3min，取上清液并加入上清液5-6 倍体积的浓度2. 5%的重铬酸钾溶液，即为收集的卵囊液； 取收集的卵囊液进行I: ISheather氏鹿糖溶液梯度离心，4000-4500rpm离心 15-20min，然后取卵囊层和1/3蔗糖溶液上清，加入其5-6倍水稀释后，进行l:2Sheather 氏蔗糖溶液梯度离心，4000-4500rpm离心15-20min，收集上层卵囊液，即为纯化后的卵囊 液； 其中，所述I: ISheather氏鹿糖溶液是指卵囊液和Sheather氏鹿糖溶液的体积比为 1:1 ;所述l:2Sheather氏鹿糖溶液是指卵囊液和Sheather氏鹿糖溶液的体积比为1:2 ; 2) 猪等孢球虫卵囊DNA的提取 采用粪便基因组DNA快速提取试剂盒，按照试剂盒的操作说明，从上述纯化后的卵囊 液中提取猪等孢球虫卵囊的DNA，置-20°C冰箱保存； 3) 目的基因的LAMP扩增： 采用权利要求1所述的引物进行LAMP反应，通过实时荧光定量PCR仪对LAMP反应的 过程进行实时荧光信号的采集并监测； 反应体系根据DNA扩增试剂盒配制，所述反应系具体如下： 反应液RM(2X)12. 5yL ; Bst聚合酶I. 0 y L ; 荧光染料I 0. 5 y L ; DNA 模板 I-IOOng ; 上下游内引物的终浓度〇. 4-1. 6 y M ; 上下游外引物的终浓度〇. 1-0. 2 yM ; 上下游环引物的终浓度〇. 1-0. 8 yM ; 补充超纯水至反应总体系为25 yL，其中，所述DNA模板是指步骤2)提取的猪等孢球虫 卵囊的DNA模板。
3. 根据权利要求2所述的基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法，其特征 在于：步骤3)所述的反应条件是63°C反应lh，每隔60s用FAM通道检测一次荧光信号，以 0. 2°C /s的增量从63°C升温至95°C并采集荧光信号分析熔解曲线。
4. 根据权利要求2所述的基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法，其特征 在于：步骤2)的具体操作方法如下：具体操作方法如下：取纯化后的卵囊液200 yL于液 氮和37°C水浴锅中反复冻融5次，每次Imin ;然后加入10 y L的蛋白酶K和50 y L溶菌 酶，涡漩混匀lmin，37°C水浴15min，期间每隔2-3min剧烈震荡混匀；然后加入100 y L的 DNA提取液，涡漩混匀lmin，65°C水浴lOmin，期间每隔2-3min剧烈震荡混匀；1000 Orpm离 心lOmin，取上清至新的I. 5mL离心管，加入约为上清的1/3体积蛋白沉淀液，混勾；冰浴 8min，13000rpm离心10min，将上清置于处理后的纯化柱，4000rpm离心3min ;将虑液置于 新的离心管中，并与滤液0. 6倍体积的异丙醇震荡混匀，13000rpm离心10min，倒扣离心管 2min ;70 %乙醇洗涤沉淀，30 y L洗脱缓冲液EB溶解沉淀，将提取的猪等孢球虫卵囊DNA 置-20°C冰箱保存。
【专利摘要】本发明公开了一种基于LAMP实时荧光法的猪等孢球虫卵囊检测方法及其引物，根据猪等孢球虫18S rRNA设计了特异引物，结合荧光定量PCR仪，建立了猪等孢球虫的LAMP实时荧光检测技术。采用本发明方法，猪等孢球虫重组质粒的检测极限是2.74×102 拷贝/μL，换算成质粒DNA浓度为1fg/μL；提取特定个数卵囊的LAMP检测试验结果显示，LAMP的检测极限为5个卵囊的DNA。本发明LAMP实时荧光检测技术的建立为猪等孢球虫的分子检测提供了一种极具价值的检测方法，弥补了传统显微镜检测法的不足。
【IPC分类】C12Q1-04, C12R1-90, C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104862415
【申请号】CN201510344540
【发明人】王寿昆, 黄翠琴, 温福利, 岳良平
【申请人】龙岩学院, 福建农林大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月19日