一株多菌灵降解菌mbc-6f及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的微细菌属(Microbacterium),具体涉及一种能够降解多菌灵(carbendazim，MBC )的微细菌MBC-6F及该菌对多菌灵的降解测定。
【背景技术】
[0002]多菌灵(carbendazim)，又名棉萎灵、贝芬替、苯并咪挫44号，英文商品名MBCjg对分子质量为191.2，分子式为=C9H9N3O2，多菌灵是广谱性杀菌剂，2011年以来，每年使用量约在4万吨，2012年其登记的产品数达857个，剂型包括原药、粉剂、悬浮剂、可湿性粉剂、悬乳剂、种衣剂等近十种。在我国，多菌灵广泛应用于小麦、果树、茶叶、蔬菜等病害的防治，还用于水果的采后保鲜。在农业上，主要用于防治麦类赤霉病、水稻纹枯病、稻瘟病、菌核病；果树和蔬菜的白粉病、炭疽病、黑星病、灰霉病等；种苗处理可防治禾谷类作物黑穗病和瓜类、番茄枯萎病等。工业上，多菌灵可用于纺织、造纸、皮革、橡胶等材料的防霉防腐。另外，苯菌灵、苯并咪唑类和托布津类杀菌剂在土壤中和作物体中也是通过转化为多菌灵而起作用。
[0003]多年来大量连续使用内吸性杀菌剂多菌灵，使得许多植物病菌对其产生了抗药性，如黄瓜灰霉病菌，油菜菌核病菌，番茄灰霉菌，稻瘟病菌，芒果炭疽病菌等。为了达到防治效果，农民加大了施用量，致使土壤中多菌灵含量经积累作用达到了很高的浓度，也导致了其在农产品中的残留量严重超标的问题。我国GB18406.1-2001标准规定，蔬菜水果中多菌灵残留量不得超过0.5mg/kg。2007年，欧盟委员会发布2007/12/EC指令，修订了苯菌灵(Benomyl )、多菌灵(Carbendazim)、戊菌挫(Penconazole)三种杀菌剂的残留限量，值得关注的是，多菌灵和苯菌灵在柑橘中的限量指标由原来的5mg/kg修订为0.05mg/kg，严格了100倍，食用菌类中的最大残留限量由I mg/kg调整为0.1 mg/kg，严格了 10倍。由于多菌灵在环境中的稳定性和长期性，因此，通过自然迀移和生物链传播，对土壤、植物、动物和地下水生产了很大影响。尤其是饮用水和农产品中多菌灵污染超标严重，已对直接或间接接触多菌灵的人和动物的健康构成了严重威胁。
[0004]多菌灵的毒性作用包括以下4方面:(I)致癌、致突变毒性:小鼠试验证实多菌灵会诱发小鼠肝脏癌变，然而结合其他试验数据，植物科学委员会(Scientific Committeeon Plants)认为由多菌灵引起小鼠肝脏肿瘤不足以得出多菌灵对人也有致癌作用的推论。但是，多菌灵确实对染色体具有致突变能力，有学者测验了多菌灵对人类淋巴细胞培养物的影响，结果发现多菌灵是一种作用很强的非整倍体剂，即使是在低剂量的情况下，也会影响染色体的数量。这是因为多菌灵能抑制微管蛋白的聚合，而微管蛋白对细胞分裂中染色体的分离具有重要作用。(2)生殖毒性:多菌灵是一种内分泌干扰素，能破坏哺乳动物子宫发育，干扰成年鼠的精子和睾丸发育。研宄发现多菌灵作用剂量超过50mg/kg时，明显可见大鼠睾丸的重量减轻、生精小管萎缩和输精小管闭锁。倘若大鼠在交配前接触过多菌灵，雌性后代会表现出雄激素特性的发育毒性，如没有阴道、子宫角不完全发育等，表明多菌灵的毒性作用可能与雄激素和雄激素受体依赖机制有关。(3)胚胎毒性:让喂食多菌灵饲料60d的雄性小鼠与正常雌性小鼠交配，发现虽然雌性小鼠的受孕率和平均着床数没有受到明显影响，但死胎率有所增加。若使6~15d的孕鼠染上多菌灵，35mg/kg的剂量便可产生明显的胚胎毒性，表现为吸收胎增多、活胎数减少、胎儿体重减轻，甚至胎儿畸形，若剂量增加到160mg/kg，则无胎儿形成。(4)其他毒性作用:多菌灵对蜜蜂无毒，对鸟类低毒。对鱼类和其他水生生物有毒性，例如淡水鱼、蓝鳃太阳鱼、糠虾和水生无脊椎动物的LC5tl分别为
0.36mg/L、5.5mg/L、0.098mg/L和0.087mg/L。因为水中的沉积物会吸附多菌灵，所以毒性通常不会太高，但依赖沉积物生存的生物很可能会受到高剂量多菌灵的影响。土壤有机物对多菌灵有强烈的吸附作用，导致土壤中蚯蚓和线虫数目减少。
[0005]多菌灵化学性质稳定、低于50 °C时至少可稳定两年；在碱性溶液中缓慢分解，随PH值升高，分解加快，而在酸性溶液中稳定。在水环境中可被紫外光解，而在土壤环境中，可与土壤颗粒不同程度的结合，主要靠微生物的降解，其半衰期在裸露的土壤中为6?12个月，在有植被的土壤中为3?6个月。微生物降解是目前有机农药残留最主要的去除途径。
[0006]我国是农业大国，同时也是农药生产和使用大国，每年农药的使用量达50万t，其中约有80%的农药直接进入环境，受农药污染的耕地面积至少有1300~1600万公顷。分离和筛选高效农药降解菌，将有助于解决土壤农药污染严重的问题，减少通过地表径流或农田渗漏形成的农药对水环境的污染，提高农产品质量安全，促进我国农业的可持续发展。
【发明内容】
[0007]针对现存多菌灵降解微生物的数量局限性，本发明的目的在找到一种对多菌灵具有高效降解效率的新多菌灵降解菌，它能有效的降解多菌灵，为多菌灵农药残留问题的解决奠定了基础，也为多菌灵高效降解酶的研发提供材料。
[0008]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:一种能够有效降解多菌灵的多菌灵降懷售[Microbacterium sp.MBC-6F，于2014年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC NO:M 2014680，保藏地址:中国武汉武汉大学。
[0009]1、多菌灵降解菌的筛选、分离与纯化。
[0010]取新鲜的土样样品于以多菌灵为唯一碳源的富集培养基，周期性的提高多菌灵浓度至300 mg/L，进行富集驯化培养，取KT1?10 _n梯度稀释的驯化富集培养液进行菌的分离纯化培养，得土壤中的多菌灵降解菌纯化菌种MBC-6F。
[0011]2、多菌灵降解菌MBC-6F的鉴定。
[0012]通过5000倍扫描电镜对多菌灵降解菌MBC-6F的微观形态学进行了鉴定。MBC-6F的16S rDNA分子学鉴定委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行。鉴定结果应用ClustalX 1.83 vers1n和MEGA 4.0软件采用相邻连接法构建系统发育树。
[0013]3、多菌灵降解菌对多菌灵的降解测定。
[0014]以5%的接种量接种纯化的多菌灵降解菌MBC-6F于降解培养基中，定时取样后进行HPLC-MS测定，通过多菌灵的含量测定确定多菌灵降解菌MBC-6F对多菌灵的降解效率，并进一步确定多菌灵降解菌MBC-6F对多菌灵的降解产物。
[0015]4、多菌灵降解菌的降解条件探讨。
[0016]用单因素法分别分析了多菌灵降解菌MBC-6F在不同温度，酸度及接种量梯度变化条件下对多菌灵的降解情况。探讨多菌灵降解菌MBC-6F对多菌灵的最优降解条件。
【附图说明】
[0017]图1多菌灵降解菌MBC-6F菌株的单个菌落形态照片；
图2多菌灵降解菌MBC-6F 5000倍扫描电镜照片；
图3利用MEGA软件构建多菌灵降解菌MBC-6F系统进化树结构图；
图4 MBC-6F菌降解多菌灵的降解产物质谱图；
图5 MBC-6F菌对多菌灵的降解率；
图6温度对MBC-6F降解多菌灵的影响；
图7pH对MBC-6F降解多菌灵的影响；
图8接种量对MBC-6F降解多菌灵的影响。
【具体实施方式】
[0018]以下结合发明人给出的附图和具体试验例来进一步说明
1、多菌灵降解菌的筛选、分离与纯化:
(I)供试样品:2013年5月采样与西北农林科技大学园艺学院连续施用多菌灵的温室大棚土壤。
[0019](2)培养基
LB液体培养基:NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,加入蒸馏水100mL,调节pH值为7.0。