α-淀粉酶以及对其进行编码的多核苷酸的利记博彩app
【专利说明】a-淀粉酶W及对其进行编码的多核音酸
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[000引发明背景 发明领域
[0004] 本发明设及a-淀粉酶、编码该些a-淀粉酶的多核巧酸、生产该些a-淀粉酶的 方法、和使用该些a-淀粉酶的方法。在本披露的实施例中，生淀粉（rawstarch)降解活 性被改善。
[0005] 相关技术说明
[0006] 淀粉的酶降解是很多工业过程中的部分，该些工业过程包括酿造、葡萄糖或高果 糖糖浆的生产W及饮用或燃料己醇的生产。在天然的状态中，淀粉非常耐受很多酶的降解， 并因此传统上通过一个对淀粉进行糊化的加热步骤来启动淀粉的工业酶降解，该使得淀粉 对很多酶更加敏感。一些酶可W作用于未糊化的淀粉，并且通常被提及为具有生淀粉降解 活性。该些酶的使用允许改善工艺，包括例如减少加工淀粉中的加热步骤。
[0007]a-淀粉酶（a-1，4-葡聚糖4葡聚糖水解酶，EC3. 2. 1. 1)构成催化淀粉W及其 他直链和支链1，4葡糖巧寡糖和多糖的水解的一组酶。a-淀粉酶已经用于各种不同的 工业目的，包括淀粉液化、己醇生产、纺织品脱浆、纺织品洗漆、纸张和纸浆工业中的淀粉改 性、酿造和烘赔。
[000引W0 2010/091221披露了一种来自±曲霉的具有a-淀粉酶活性的多肤。数据库 化iProtXP002576027披露了来自Q0C881(±曲霉）基因组针对a-淀粉酶的核酸序列。
[0009]W0 2008/080093披露了a-淀粉酶和葡糖淀粉酶W及其在制造燃料中的用途。
[0010] 在本领域中仍然需要改进的a-淀粉酶，包括具有生淀粉降解活性的a-淀粉酶。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明设及具有a-淀粉酶活性的多肤，该些多肤选自下组，该组由W下各项组 成：
[0013] (a) -种包括SEQIDN0:2、SEQIDN0:4或SEQIDN0:6的氨基酸序列的成熟多 肤的氨基酸序列或由其组成的多肤；
[0014] 化）一种包括与SEQIDN0:2、SEQIDN0:4或SEQIDN0:6的氨基酸序列的成熟 多肤具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的多肤；
[0015] (C)一种由W下多核巧酸编码的多肤，该多核巧酸在中严格条件下与SEQID N0:1、SEQIDN0:3或SEQIDN0:5的成熟多肤编码序列杂交。在实施例中，本披露的多肤 是分离的。
[0016] 本发明还设及编码本发明的多肤的多核巧酸；核酸构建体；重组表达载体；包括 该些多核巧酸的重组宿主细胞；W及产生该些多肤的方法。
[0017] 本发明另外设及用一种编码本发明的多肤的多核巧酸转化的一种转基因植物、植 物部分或植物细胞。
[0018] 在又另外的方面中，本发明设及包括一种本发明的多肤的组合物，包括用于生产 己醇的组合物。
[0019] 本发明还设及使用一种本发明的多肤生产己醇的方法。本发明还设及使用一种本 发明的多肤从未糊化的淀粉生产己醇的方法。
[0020] 定义
[0021] a-淀粉酶活性；在此将术语"a-淀粉酶活性"定义为一种催化包含=个或更多 个（1，4) -a-连接的D-葡萄糖单位的多糖中的（1，4) -a-D-糖巧键的内切水解的活性。术 语"a-淀粉酶活性"对应于在E.C. 3. 2. 1. 1中分类的酶。出于本发明的目的，根据"实例" 部分所述的程序确定a-淀粉酶活性。
[0022] 等位基因变体；术语"等位基因变体"意指占据同一染色体基因座的基因的两种或 更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可W导致群体内的多 态性。基因突变可W是沉默的（在所编码的多肤中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肤。多肤的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肤。
[002引cDNA;术语"cDNA"是指可W通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分 子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可W存在于对应基因组DNA中的内含子序列。 早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的 步骤进行加工，包括剪接。
[0024] 编码序列；术语"编码序列"意指直接指定一个多肤的氨基酸序列的多核巧酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且W-个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可W是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0025] 控制序列；术语"控制序列"意指对于表达编码本发明的成熟多肤的多核巧酸所必 需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肤的多核巧酸来说可W是天然的（即，来自相 同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列 包括但不限于前导子、聚腺巧酸化序列、前肤序列、启动子、信号肤序列、W及转录终止子。 至少，控制序列包括启动子，W及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将该些控制序列与 编码一种多肤的多核巧酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，该些控制序列可W 提供有多个接头。
[0026] 表达；术语"表达"包括设及多肤产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、W及分泌。
[0027] 表达载体；术语"表达载体"意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肤的多 核巧酸并且该多核巧酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
[0028] 片段；术语"片段"意指具有从成熟多肤或结构域的氨基和/或駿基末端缺失的一 个或多个（例如，若干个）氨基酸的本发明的多肤；其中该片段具有a-淀粉酶活性。在一 个方面，一个片段包含了SEQIDN0:2或6的至少497个氨基酸残基、至少526个氨基酸残 基或至少555个氨基酸残基。在另一个方面，一个片段含有SEQIDNO: 4的至少528个氨 基酸残基、至少559个氨基酸残基或至少590个氨基酸残基。
[0029] 高严格条件；术语"高严格条件"意指对于长度为至少100个核巧酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性的蛙鱼 精子DM和50%甲酯胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0. 2%SDS，在65°C下洗漆=次，每次15分钟。
[0030] 宿主细胞；术语"宿主细胞"意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的 多核巧酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语"宿主细胞"涵 盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0031] 分离的；术语"分离的"意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的 物质的非限制性实例包括（1)任何非天然发生的物质，（2)包括但不限于任何酶、变体、核 酸、蛋白质、肤或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所 有天然发生的成分中去除；（3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或（4)通 过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质（例如，编码该物质 的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子）。一种分离的 物质可W存在于发酵液样品中。例如，本发明的多肤可W按发酵液产物的形式用于工业应 用中，即，本发明的多肤是用作工业应用（例如，己醇生产）中产物的发酵液的组分。除本 发明的多肤外，该发酵液产物将包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞（包括 含有编码本发明的多肤的基因的宿主细胞，该些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肤）、细胞 碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。该发酵液可W任选地经受一个或多个纯化（包括 过滤）步骤，W除去或降低发酵过程中的再一个组分。因此，本发明的"分离的"多肤可W 存在于此类发酵液产物中。
[003引成熟多肤；术语"成熟多肤"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磯酸化作用等之后处于其最终形式的多肤。本领域中已知的是，一个 宿主细胞可W产生由同一多核巧酸表达的两种或更多种不同成熟多肤（即，具有不同C-末 端和/或N-末端氨基酸）的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肤，并 且因此一个表达一种多核巧酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核巧酸的宿主细胞相比 时可W产生一种不同的成熟多肤（例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基）。
[0033] 在一个方面中，基于预测SEQIDN0:2的氨基酸-1至-21是信号肤的SignalP(巧 尔森（Nielsen)等人，1997,蛋白质工程（ProteinElngineering) 10:1-6)，该成熟多肤是 SEQIDNO:2的氨基酸1至585。
[0034] 在另一个方面，基于预测SEQIDN0:4的氨基酸-1至-21是信号肤的SignalP程 序（巧尔森（Nielsen)等人，1997,蛋白质工程（ProteinElngineering) 10:1-6)，该成熟多 肤是SEQIDNO:4的氨基酸1至622。
[00巧]在另一个方面，基于预测SEQIDNO:6的氨基酸-1至-21是信号肤的SignalP程 序（巧尔森（Nielsen)等人，1997,蛋白质工程（ProteinElngineering) 10:1-6)，该成熟多 肤是SEQIDNO:6的氨基酸1至607。
[0036] 成熟多肤编码序列；术语"成熟多肤编码序列"意指编码具有a-淀粉酶活性的成 熟多肤的多核巧酸。
[0037] 中严格条件；术语"中严格条件"意指对于长度为至少100个核巧酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性的蛙鱼 精子DNA和35%甲酯胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0. 2% SDS，在55°C下洗漆=次，每次15分钟。
[003引中-高严格条件；术语"中-高严格条件"意指对于长度为至少100个核巧酸的探 针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSS阳、0. 3%SDS、200微克/ml剪切并变性 的蛙鱼精子DNA和35%甲酯胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、 0. 2%SDS，在60°C下洗漆S次，每次15分钟。
[0039] 核酸构建体；术语"核酸构建体"意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是 从天然存在的基因中分离的，或者W-种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸 的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列
[0040] 可操作地连接；术语"可操作地连接"意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核 巧酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0041] 序列一致性；两个氨基酸序列之间或者两个核巧酸序列之间的关联度通过参数 "序列一致性"来描述。
[0042] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS;欧洲分子生物学开放软件套件 (TheEluropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),赖斯巧ice)等人，2000,遗 传学趋势（TrendsGenet.) 16:276-277)(优选5. 0.0版或更新版本）的巧德尔（Needle) 程序中所实施的巧德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(巧德尔曼）和 Wunsch(翁施），1970,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸 序列之间的序列一致性。使用的该些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5,W及 E化0SUM62炬L0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。巧德尔标注的"最长的一致性""的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[00