一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使 用方法。
【背景技术】
[0002]多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临 床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之 一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原 因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。
[0003] 传统的男性不育的诊断方法是利用精子的活力分析，精子计数等方法，而这类方 法具有如下的特点： 1、 精子计数受到外界的影响因素较多，如吸烟、饮酒等都会造成结果的波动较大； 2、 精子的活力分析需要昂贵的仪器分析，且与受试者是否近期有同房等因素有显著相 关； 3、 目前的方法都是基于精液的检测方法，收集样本的过程较为繁琐。
[0004] 而采用血浆的分子标记物的检测方法具有采样简单、直接，可以直接反映病人的 生育水平的特点。如201310112391. 1，名称为"男性不育的生物标志物及其应用"的发明专 利申请，检测受试者体液中至少一种指示男性不育生物标志物的水平，其中至少一种指示 男性不育生物标志物选自乙酰肉碱、天冬氨酸、肉碱C3 :1、酮肉碱、亮氨酰脯氨酸、肉碱C8、 甲基黄嘌呤、肉碱C10 :2、肉碱C10 :1、腺嘌呤；所述体液选自受试者尿液、血清、血浆、血液、 精液、精子、精浆、唾液。该检测方法需要高效液相层析分析仪等昂贵的仪器，另一方面，需 要同时检测多个生物标记物，且通过受试者操作曲线（R0C)，这一反映生物标记物的经典方 法发现，即使采用多个标记物组合其曲线下面积（AUC)最高为0. 73,对应的敏感性与特异 性仅为65 %与71%。 201310722584. 9,名称为"一种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法"的发明专利申 请，通过抽提口腔上皮细胞样本的基因组DNA，再经荧光定量PCR反应检测分析个体的N0S3 基因、FASLG基因SNPs位点基因携带型，为所有的受检者提供精子细胞凋亡相关基因检测， 并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男 性的不育发病风险进行预测评估。该检测方法是从基因多态的层面提取口腔上皮细胞的 DNA，进行基因扩增后观察基因多态性与无精子的相关情况，从DNA的水平观察其与无精症 的相关情况，其DNA变异与无精症仅为相关性研宄，没有对检测方法与精子产生等参数关 联的具体相关性的资料，敏感性与特异性低，不具有实用性。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用 方法。本发明发现了一种在精子发生过程中起重要作用的微小RNA (miRNA)基因miR-15b， miR-15b在男性不育病人中的表达差异，并且可以在血浆中检测到其表达的显著变化。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案： 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：用于测定血浆miR-15b的不同表达 水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过度表达提示男性无精症。
[0007] 本发明所述 miR-15b 的基因序列为：5' -TAGCAGCACA TCATGGITTA C。
[0008] 本发明所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和 miR-15b特异性引物探针。
[0009] 所述的质控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平。
[0010] 所述的正常生精者的血浆中miR-15b含量大于2000万/毫升。
[0011] 优选地，所述的miR-15b特异性引物探针为Taqman探针，具有高适应性和可靠性， 实验结果稳定重复性好，特异性更高。
[0012] 本发明所述的男性不育诊断的试剂盒的使用方法，步骤如下： A、 RNA提取：采用血浆RNA抽提试剂提取血浆样本中的RNA ; B、 荧光定量PCR :对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，用Taqman探针 法进行PCR反应，检测受试样本与质控品的Ct值； C、 结果判定：将检测值采用2- AA Ct方法换算成相对表达量，以相对表达值4. 2为临 界值，超过4. 2即推测为无精症。
[0013] 本发明的试剂盒可用于诊断男性无精症，推断男性不育，实现了荧光信号的累积 与PCR产物形成完全同步，其预测男性不育的敏感性与特异性分别为71. 4%与100%，特异性 好，定量结果准确性高，具有良好的检测效能，是测定的金标准。
[0014] 相对于传统的精子活力与计数的方法相比，有如下优点： 1、检测所需的样本量少，速度快，时间短，可用于评估精子质量与功能的实验室检测， 可为临床原因不明的男性不育患者提供检测及临床咨询。
[0015] 2、试剂盒的检测对象为血浆样本，而非从精液中分离精子样本，是一种快速与准 确的筛选男性精子发生障碍的新的方法。
[0016] 3、本试剂盒基于定量PCR的原理，结果重复性好，客观准确，易于在不同的检测机 构与医院检验科，男科实验室等推广。
【附图说明】
[0017] 图1为动物模型的结果分析。
[0018] (a)构建通过PGK2启动子在生精细胞特异的过表达miR-15b的转基因小鼠。
[0019] (b ) PCR鉴定出阳性的转基因小鼠模型。
[0020] (c)miR_15b转基因小鼠的睾丸H & E染色显示出现精子发生缺陷，未成熟精子细 胞脱落。左边为正常对照小鼠睾丸切片。
[0021] (d)附睾中收集的精子计数结果。
[0022] (e)miR_15b转基因小鼠的曲精小管的直径。
[0023] (f) miR-15b转基因小鼠血浆的miR-15b表达。
[0024] (g) Western blot结果显示miR_15b调控的下游基因Cdc25a的表达。
[0025] 图2为男性无精症与正常受试者经试剂盒检测得到的miR_15b相对表达量的分布 图。
[0026] 图3为本发明试剂盒对无精症诊断的特异性和敏感性分布图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
[0028] 实施例1 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR_15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR_15b的过高表达提示男性无精症。
[0029] 实施例2 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。
[0030] 所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特 异性引物探针。
[0031] 实施例3 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。
[0032] 所述的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特 异性引物探针。
[0033] 所述的质控品为正常受试者的血浆miR_15b表达水平。
[0034] 实施例4 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。
[0035] 所述的男性无精症诊断的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反 应体系和miR-15b特异性引物探针。
[0036] 所述的质控品为正常生精者的血浆miR_15b表达水平。
[0037] 所述的miR_15b特异性引物探针为Taqman探针。
[0038] 实施例5 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标 志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示男性无精症。
[0039] 所述的男性无精症诊断的试剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反 应体系和miR-15b特异性引物探针。
[0040] 所述的质控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平，血浆中精子含量大于2000 万/毫升。
[0041] 实施例6 本发明所述的男性无精症诊断试剂盒的使用方法，步骤如下： A、 RNA提取：采用血浆RNA抽提试剂提取血浆样本中的RNA ; B、 荧光定量PCR :对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，用Taqman探针 法进行PCR反应，检测受试样本与质控品的Ct值； C、 结果判定：将检测值采用2-AACt方法换算成相对表达量。
[0042] 具体实验操作如下： 1、RNA提取：用含EDTA抗凝剂的采血管收集3ml全血，3000g，4 °C离心10min，收 集上层黄色半透明液体就是血浆，大约有500ul血浆，用mirVana? PARIS? Kit (Life technologies，AM1556)血浆提取试剂盒提取RNA。具体操作为： a.使用前将2X变性缓冲液37 °C放置。
[0043] b. 500ul血浆样本加入等体积的2X变性缓冲液，在加入1ml氯仿涡旋60s， 10000g，5min，室温放置。
[0044] c.将上清转移到新的EP管中，加入1. 25倍体积的100%乙醇，加入过滤芯离心，弃 溶液。
[0045] d?洗液1，洗涤一次，10000g，30s。
[0046] e?洗液 2/3,洗涤两次，10000g，30s。
[0047] f ?空气分离。
[0048] g.加入100ul 95°C预热的洗脱液溶解收集RNA。
[0049] 2、反转录：反转录体系采用的引物来自于反转录试剂盒P/N 4366596 (Life公 司，美国）。
[0050] 1)按表1顺序配制反转录反应体系 表1
【主权项】
1. 一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：用于测定血浆miR-15b的不同表 达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过度表达提示无精症。
2. 根据权利要求1所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：所述的试 剂盒包括质控品、反转录体系、PCR扩增miRNAs的反应体系和miR-15b特异性引物探针。
3. 根据权利要求2所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：所述的质 控品为正常生精者的血浆miR-15b表达水平。
4. 根据权利要求2所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒，其特征在于：所述的 miR_15b特异性引物探针为Taqman探针。
5. 根据权利要求1所述的一种用于男性无精症诊断的试剂盒的使用方法，其特征在 于：步骤如下： A、 RNA提取：采用血浆RNA抽提试剂提取血浆样本中的RNA ; B、 荧光定量PCR :对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，用Taqman探针 法进行PCR反应，检测受试样本与质控品的Ct值； C、 结果判定：将检测值采用2-AACt方法换算成相对表达量。
【专利摘要】本发明提供了一种用于男性无精症诊断的试剂盒和使用方法。该试剂盒为用于测定血浆miR-15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过miR-15b的过高表达提示无精症。本发明发现了一种在精子发生过程中起重要作用的微小RNA基因miR-15b，miR-15b在男性不育病人中的表达差异，并且可以在血浆中检测到其表达的显著变化。试剂盒基于定量PCR的原理，结果重复性好，客观准确，易于在不同的检测机构与医院检验科，男科实验室等推广。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104846087
【申请号】CN201510220417
【发明人】许文明, 陈艳, 廖惠娟, 岳焕勋, 杨明, 孙华钦
【申请人】四川大学华西第二医院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月4日