寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用
【专利说明】寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩増目标核酸序列变异 体的方法及应用
[0001] 本申请要求申请日为2015年4月15日、申请号为201510177952.5、发明名称为 "寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用"的中国专利 申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
[0002] 本发明属于分子生物学领域，涉及选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，具体 是涉及一种寡聚核苷酸片段、及使用其进行选择性扩增目标核酸序列变异体的方法。本发 明还涉及检测核酸变异体的试剂盒的应用，广泛应用于核酸扩增、肿瘤体外诊断、基因分型 等领域。
【背景技术】
[0003] 等位基因一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因， 具有多态性。等位基因多态性分析应用的领域广泛，包括法医鉴定、药性分析、基因分型、器 官移植，也包括检测大量野生型基因背景的肿瘤细胞中的基因突变等。但是通常情况下，月中 瘤细胞相较于周围正常的组织细胞所占的比例相当低，检测到肿瘤细胞十分困难，尤其检 测大量野生型基因背景中肿瘤基因的单点突变尤为困难。为了检测少量的目的核酸序列的 突变变异体，目前一般将选择性扩增的方法与选择性检测的方法结合进行检测。选择性检 测方法有高分辨率熔解曲线、探针杂交、TaqMan?探针等方法。美国专利公开的（U.S. Pat. Nos. 5, 210, 015, 5, 538, 848and 6, 326, 145) TaqMan?探针方法是探针特异性的与待检测核 酸片段杂交，并且在具有5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶的作用下酶切，所产生信号用来 指示存在待检测目的片段。但由于突变型变异体所占比例十分稀少，易导致信号淹没在与 待检测目的序列突变型变异体相似的野生型变异体所产生的信号中，而选择性扩增法的选 择性较高。
[0004] 因此，等位基因选择性扩增允许我们选择性的扩增并检测目的核酸序列的突变型 变异体。在一个成功的选择性扩增系统中，只有目的核酸序列中的突变型变异体被扩增，而 目的核酸序列的野生型变异体不被扩增、或者目的核酸序列的野生型变异体的扩增效率远 远低于目的核酸序列中突变型变异体的扩增效率。为了达到选择性扩增的目的，多种方法 被开发出来，如下述的PCR夹子方法、RFLP-PCR方法、数字PCR方法、低变性温度下共扩增 PCR方法。
[0005] PCR夹子方法（PCR clamping method)通过抑制目的核酸序列的野生型变异体的 扩增来达到选择性扩增待检测目的片段的目的。使用肽核酸（PNA)或使用锁核酸（LNA)的 方法分别在文献[Henrik et al.，Nucleic Acid Research21:5332-5336 (1993)]和[Luo et al.，Nucleic Acid Research Vol. 34, No 2el2 (2006)]中公开。但是，与目的核酸序列 的野生型变异体与突变型变异体通常只有一个碱基与待检测目的片段不同，这种方法并不 能完美的抑制住这些非目的片段的扩增。
[0006] RFLP-PCR方法通过在PCR反应之前或是在PCR反应的过程中使用限制性内切 酶，除去了与目的核酸序列突变型变异体相似的野生型变异体，从而达到扩增并富集目的 核酸片段的突变型变异体的目的。基于此方法有多种变化，包括限制性酶切位点突变分析 PCR(RSM-PCR)方法，通过在突变位点基于引物连接的扩增（APRIL-ATM)方法等等。虽然这 类方法具有设计简单和成本低廉的优点，并且在一些特定的实验中具有较好的选择性，但 是它依赖于突变位点附近具有限制性内切酶酶切位点，在具体应用中，这类方法的选择性 有限。
[0007] 数字PCR(digital PCR)通过稀释模板和增加PCR反应的数目来检测少量目 的核酸序列突变型变异体[Vogelstein B, Kinzler KW. Digital PCR. ProcNatlAcad SciUSA1999 ;96:9236-41]。理论上，当核酸模板稀释到每个PCR反应中仅有一个或没有核 酸模板时，这个PCR反应中要么没有扩增，要么扩增野生型模板或扩增突变型模板。结合 相应的检测方法即可以达到检测少量突变型变异体的目的。理论上，该方法通过增加PCR 反应的数量选择性是无限的。但是在实际操作中，选择性不仅受限于Taq DNA聚合酶的保 真性限制，也受限于同时能进行的PCR数目。虽然有报道基于数字PCR的方法具有高选择 性，如[Bielas JH, Loeb LA. Quantification of random genomic mutations. Nat Methods 2005 ;2:285-90]所公开的内容。但该法通常需要专门的仪器并借助芯片技术，过程非常繁 琐复杂，成本较高。
[0008] 低变性温度下共扩增 PCR(Coamplification at lower denaturation temperature PCR，Cold-PCR)是一种通过调节PCR反应的热循环条件来富集目的扩增片段 的方法。在低变形温度下（Tc)，目的核酸序列的突变型变异体或者突变型变异体与野生型 变异体形成的异源二聚体相较于野生型变异体更容易变性而被进一步扩增并富集。该方 法能提供一定的选择性，但是这种选择性仍然是不够的，如[Li J，Wang L，Mamon H，Kulke MH，Berbeco R，Makrigiorgos GM. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med 2008 ； 14:579 - 84]所公开的内容。
[0009] 在一个典型的聚合酶链式反应PCR中，上游引物与下游引物分别与目的基因的两 条链完全互补。如果在引物的3'末端有一个或多个碱基的不匹配则有可能造成扩增效率 的大幅度降低，这样的错配有的影响较大而有的影响较小。在检测单点突变的体系中，有人 将引物3'末端最后一个碱基或倒数第二个碱基设计成与突变位点完全互补匹配，从而选择 性的扩增突变基因而对正常非突变基因扩增效率很低，这种方法称为等位基因特异性扩增 方法（见U. S. Pat 5639611)。这种选择性扩增的方法可以通过调节体系的反应条件来达到 较佳选择性。但尽管如此，等位基因特异性PCR在很多应用中选择性远远不够。
[0010] 针对提高选择性的研宄，一种改良的方法是在引物中额外引入一个突变位点来提 高体系的选择性（见U. S. Pat. No. 5137806)，另一方法通过使用化学修饰的引物来提高等 位基因特异性PCR方法的特异性。如对引物上某些核苷酸上脱氧核糖特定位置的2'-C、 4' -C 修饰可提高选择性[Gaster, J. and Marx, A Chem. Eur. J. 2005, 11:1861-1870]。还有 在引物中引入一个不常见碱基提高体系的选择性的方法（见U.S. Pat No. 7408051)，及用 热稳定性的错配结合蛋白来提高体系的特异选择性的方法（见US 5877280)。
[0011] 在等位基因特异性PCR中，体系的选择性是靠扩增的Ct之间的差值来体现的。引 物扩增完全匹配的模板和不完全匹配的模板效率是不同的，产生不同的ct值，他们之间的 ct值差异越大，体系的选择性越好。这种差别的分辨率在很多应用中是足够的，但是在检测 肿瘤组织中大量野生型变异体中存在的少量突变型变异体时，这种分辨率可能是不够的。 通过前述一系列方法虽然可以提高一定的分辨率，但具体应用时提高仍有限。并且，如果使 用3'末端错配的引物一旦错误延伸就相当于人为的引入突变型的变异体，这种人为引入的 突变型变异体在随后的每一轮循环中易被作为突变型变异体被扩增。
【发明内容】
[0012] 本发明提供一种寡聚核苷酸片段，采用该寡聚核苷酸片段可以选择性扩增目标核 酸序列变异体，可应用于检测核酸变异体的试剂盒中，广泛适用核酸扩增、肿瘤体外诊断、 基因分型等领域。
[0013] 本发明提供的寡聚核苷酸片段，包含以共价相连的引物区和变异体识别区，引物 区在3'端，变异体识别区在5'端，所述变异体识别区共价连接有核酸双链稳定因子或含有 不能被核酸酶水解的修饰因子，所述变异体识别区与所述引物区延伸产生的序列形成发夹 结构。
[0014] 本发明进一步地，所述修饰因子包括碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物、肽 核酸或硫代磷酸酯。
[0015] 本发明进一步地，所述的核酸双链稳定因子包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合 物/类似物中的一种或一种以上的组合。
[0016] 本发明进一步地，核酸双链稳定因子与变异体识别区直接连接、或者通过共价相 连。
[0017] 本发明还提供一种选择性扩增目标核酸序列变异体的方法，采用任一项所述的寡 聚核苷酸片段进行选择性扩增，该方法包括：
[0018] ⑴将所述寡聚核苷酸片段中引物区与目标核酸序列在反应体系中进行杂交，为扩 增准备模板；
[0019] ⑵在扩增体系中，所述引物区的3'末端被核酸聚合酶延伸；
[0020] ⑶以所述待检测样品中的变异体作为模板时，寡聚核苷酸片段变异体识别区与引 物区延伸，产生的序列无法形成稳定的发夹结构，扩增反应进行，
[0021] 以所述待检测样品中的非待检测核酸变异体作为模板时，寡聚核苷酸片段变异体 识别区与引物区延伸，产生的序列形成发夹结构，扩增反应被抑制。
[0022] 本发明进一步地，结结合使用一种不区分不同核酸变异体的检测方法，包括染料 法、杂交探针检测法、水解探针检测法、Taqman探针法或分子信标法。
[0023] 本发明进一步地，结合使用一种区分不同核酸变异体的方法，包括测序法或高分 辨率熔解曲线法，或者结合使用区分不同核酸变异体的杂交探针、区分不同核酸变异体的 水解探针、区分不同核酸变异体的Taqman探针或区分不同核酸变异体的分子信标的方法。
[0024] 本发明进一步地，所述扩增体系是一种随温度升高而启动反应的体系。。
[0025] 另一方面，本发明还提供用于检测核酸变异体的试剂盒，采用上述任一项所述的 寡聚核苷酸片段检测所述核酸变异体。
[0026] 本发明进一步地，所述试剂盒还包括核酸检测所需的试剂，所述核酸检测所需的 试剂包括核酸染料和/或探针。
[0027] 本发明进一步地，所述试剂盒还包括试剂盒扩增体系，所述试剂盒扩增体系包括 核酸聚合酶、二价金属离子、核苷酸、盐、缓冲剂或辅助因子中的一种或多种组合。
[0028] 本发明具有下述积极效果：