一种切向流超滤技术提取生姜蛋白酶的方法
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001]本发明涉及一种切向流超滤技术提取生姜蛋白酶的方法，属于轻工、食品领域。
(二)
【背景技术】
[0002]生姜蛋白酶是生姜深加工综合利用的高附加值产品之一，是一种琉基蛋白水解酶类，具有水解蛋白酶和胶原蛋白酶双重性质，可用于肉类嫩化、酒类澄清、凝乳、水解大豆蛋白等食品加工处理中，对大肠杆菌、啤酒酵母和青霉有抑制生长效果。生姜蛋白酶能特异水解脯氨酸匕位含有脯氨酸的多肽和蛋白质，这种对脯氨酸的特殊亲和性使其在生化研宄中成为一种很有前途的工具酶。
[0003]超滤是一种以压力为推动力的膜分离技术，用于截留水中胶体大小的颗粒，而水和低分子量溶质则允许透过膜。由于超滤具有设备简单、操作方便、无相变、处理效率高、节能和易于自动化等优点，故已广泛用于食品、饮料、药物、涂料等行业和物质的分离回收，在废水处理上也有较多的应用。但是普通超滤在超滤过程中，由于被截留的杂质在膜表面上不断积累，会产生浓差极化现象，当膜面溶质浓度达到某一极限时即生成凝胶层，使膜的透水量急剧下降，这使得超滤的应用受到一定程度的限制。切向流(也称为“错流”)超滤改变了普通超滤流向垂直滤膜而采用流向平行滤膜，从而可以将大分子从膜的表面带走不形成死端过滤，在渗余物流体中产生紧靠滤膜的压力，使溶质和小分子通过滤膜。切向流超滤能更快捷、高效地进行生物分子的分离与纯化处理，可用于低至10毫升、高达数千升样品溶液的浓缩和脱盐处理，也可以用于不同大小生物分子的分离、细胞悬液收集、以及发酵液和细胞裂解液的澄清。
[0004]蛋白质分离纯化是一项富有挑战性的工作。由于蛋白质存在于复杂的生物体系中，且自身不稳定，遇热或遇某些溶剂易变性失活，故传统的蒸馏、溶剂萃取等分离技术并不适用于其分离纯化，而色谱法用于蛋白质的分离纯化，虽具有高分辨率的特点，但操作繁琐、难放大、提取量少、成本高，在工业化生产中的应用受到限制。与上述方法相比，切向流超滤技术作为一种典型的膜分离技术，适用于任何能预处理成汁液的原料，无需干燥，具有应用范围更广、能耗更低、效率更高、无相变、无需添加任何化学试剂、操作简便、条件温和等诸多优点，在蛋白质脱盐、脱醇、浓缩、分级分离及内毒素去除等过程中具有广阔的应用前景。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明的目的是研发一种切向流超滤技术提取生姜蛋白酶的新方法。其方法是用乙醇法得到生姜蛋白酶溶液，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得姜酶分子量，根据姜酶分子量选择合适的膜包，用配套的切向流系统进行切向流超滤提取，分级分离，收集不同区间的液体，得到含酶溶液，置于冰浴中缓慢加入乙醇静置沉淀，再经抽滤去除上清液后收集沉淀得湿酶粉，冷冻干燥后得酶粉。(四)
【附图说明】
[0006]图1切向流超滤技术提取生姜蛋白酶的工艺流程
[0007]图1中I是鲜姜，2是乙醇法，3是生姜蛋白酶溶液，4是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，5是分子量为33.3KDa的生姜蛋白酶，6是分子量为15.7KDa的生姜蛋白酶，7是切向流系统，8是分子量为50KDa的膜包，9是分子量大于50KDa的回流端液体，10是通过50KDa膜包收集的透过端液体，11是分子量为1KDa的膜包，12分子量小于1KDa的透过端液体，13是通过1KDa膜包收集的回流端液体，14是分子量为30KDa的膜包，15是分子量在10_30KDa之间的透过端液体，16是分子量在30-50KDa之间的回流端液体，17是酶活测定，18是乙醇，19是冰浴，20抽滤，21是湿酶粉，22冷冻干燥，23酶粉。
(五)
【具体实施方式】
[0008]将鲜姜⑴用乙醇法⑵制备生姜蛋白酶溶液(3)，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(4)测出有两种生姜蛋白酶，分子量分别为33.3KDa(5)和15.7KDa(6)。根据生姜蛋白酶的分子量和现有市售膜包选择分子量为10、30、50KDa的膜包，将生姜蛋白酶溶液(3)用配套的切向流系统(7)进行超滤提取，先用分子量为50KDa的膜包(8)超滤，去掉分子量大于50KDa的回流端液体(9);收集透过端液体(10)用分子量为1KDa的膜包(11)超滤，去除分子量小于1KDa的透过端液体(12);收集回流端液体(13)用分子量为30KDa的膜包
(14)超滤，分别收集分子量在10-30KDa之间的透过端液体(15)和分子量在30_50KDa之间的回流端液体(16)，对两组液体进行酶活测定(17)，发现生姜蛋白酶主要存在于30-50KDa区间，即分子量为33.3KDa的组分(16)有酶活，将其在冰浴条件下缓慢加入乙醇(18)至终浓度为50%?70% (v/v)，冰浴(19)中静置5?8h后取出，抽滤(20)得湿酶粉(21)，冷冻干燥(22)，得酶粉(23) ο
[0009]测得生姜蛋白酶比活力大小为5.369X 106U/g，比超滤前酶比活力(3.102 X 16U/g)高 73.082% ο
[0010]应用上述方法可部分纯化并大量提取生姜蛋白酶，具有高效率、低能耗、无相变、无需添加任何化学试剂、操作简便、条件温和、得到的酶活高等诸多优点，可以提高生产效率，是一种应用性强、应用范围广的新方法，有很好的产业化和市场前景。
【主权项】
1.一种切向流超滤技术提取生姜蛋白酶的方法，其特征在于:将鲜姜用乙醇法制备生姜蛋白酶溶液，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测出有两种生姜蛋白酶，分子量分别为.33.3KDa和15.7KDa。根据生姜蛋白酶的分子量和现有市售膜包选择分子量为10、30、50KDa的膜包，将生姜蛋白酶溶液用配套的切向流系统进行超滤提取，先用分子量为50KDa的膜包超滤，去掉分子量大于50KDa的回流端液体；收集透过端液体用分子量为1KDa的膜包超滤，去除分子量小于1KDa的透过端液体；收集回流端液体用分子量为30KDa的膜包超滤，分别收集分子量在10-30KDa之间的透过端液体和分子量在30-50KDa之间的回流端液体，对两组液体进行酶活测定，发现生姜蛋白酶主要存在于30-50KDa区间，即分子量为.33.3KDa的组分有酶活，将其在冰浴条件下缓慢加入乙醇至终浓度为50%?70% (v/v)，冰浴中静置5?8h后取出，抽滤得湿酶粉，冷冻干燥，得酶粉。
【专利摘要】本发明涉及一种切向流超滤技术提取生姜蛋白酶的新方法。其方法是用乙醇法得到生姜蛋白酶溶液，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得姜酶分子量，根据姜酶分子量选择合适的膜包，用配套的切向流系统进行切向流超滤提取，分级分离，收集不同区间的液体，得到含酶溶液，置于冰浴中缓慢加入乙醇静置沉淀，再经抽滤去除上清液后收集沉淀得湿酶粉，冷冻干燥后得酶粉。
【IPC分类】C12N9-50
【公开号】CN104845956
【申请号】CN201510317142
【发明人】唐晓珍, 位思清, 乔旭光, 李锋, 高晓东, 贾传玺
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月11日