-单磷酸类脂a的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种低毒含五条脂肪酸链的Kd〇2-单磷酸类脂A的制备与应用，属于 生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 脂多糖（LPS)，即细菌内毒素，是构成大多数革兰氏阴性细菌外膜外层的主要成 分，主要由Kdo2-类脂A(Kdo2-LipidA)，核心多糖（Core)和0-抗原（O-antigen)三部分组 成；其中Kd〇2-类脂A是LPS的疏水端，其结构非常保守，连接着亲水的核心多糖和0-抗原 并协助二者粘附于细胞表面构成完整细胞壁，核心多糖和0-抗原部分具有异构性，不同的 革兰氏阴性菌株甚至同一菌株内糖基种类、个数、位置都有多种组合形式。革兰氏阴性菌侵 入宿主后会释放其表层的LPS，LPS可以被宿主免疫细胞表面的Toll样受体4(TollLike Rec印tor4,TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-a、IL-6、 IL-8等多种炎性细胞因子。其中，Kd〇2-类脂A是与TLR-4受体结合的主要部分，尤其是类 脂A部分的精细结构决定了LPS刺激细胞后释放的细胞因子种类和数量。
[0003] 野生型大肠杆菌和沙门氏菌的LPS中，类脂A部分包含六条或七条脂肪酸链，并在C1位和C4'位有两个磷酸基团，具有较高的细胞毒性。某些特殊结构、低毒性的类脂A可 作为疫苗佐剂，非特异性地增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。但是，由于类 脂A分子水溶性非常低，在水相中不能展现有效的生物活性，所以近几十年至今，基础科研 或者临床上还是使用LPS粗样来对相应的类脂A衍生物生物活性进行研宄。然而，LPS由 于分子量大、核心糖及〇抗原部分结构多样化，无法通过质谱或核磁共振的方法进行实时 检测和快速鉴定，也暂无标准化的提取纯化方法。且实际类脂A疫苗佐剂生产中，现用到的 沙门氏菌是致病菌，具有一定的安全隐患，且沙门氏菌同时生产多种不同结构的类脂A，提 取过程繁琐、能耗高。
[0004] 大肠杆菌W3110是非致病菌，其LPS部分不包含0-抗原，只有Kd〇2-类脂A与核心 多糖，且其Kd〇2-类脂A部分结构单一，是优于沙门氏菌的工业生产出发菌株。本发明改造 大肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的Kd〇2-类脂A，这种Kd〇2-类脂A不连接核心多 糖长链、仅由两个2-酮-3-脱氧辛酸、五条脂肪酸链和C4'位单个磷酸构成。这种特别的 Kd〇2-类脂A具有双亲性质，便于分离提取和纯化，能够被实施检测和直接鉴定，且保持了类 脂A部分的生物活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是优于类脂A和LPS分 子的、极具发展潜力的疫苗佐剂。同时，本发明提供一种提取和纯化Kd〇2-类脂A的标准化 方法，步骤简单明了，易于操作。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种具有特殊结构、低毒的、五脂肪酸链Kd〇2-单磷酸类脂A，其化学式为C96H175N2035P，分子质量为1947. 17,其结构包含2个a-酮 基-3-脱氧-D-甘露辛酸（Kdo)、2个氨基葡萄糖、1个磷酸基团和5条脂肪酸链，是以 0_(1' -6)连接的D-葡萄糖胺二糖为骨架，6'位连接二a-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸 (Kd〇2)，4'位被磷酸化，2'位氨基连接（R)-3-(十二烷氧基）十四烷基，3'位、3位和2位氨 基分别连接十四烷氧基而构成，具体结构式如式I所示。该化合物具双亲性，能够被有机体 系直接提取同时可被ESI质谱直接检测鉴定；在水相体系有较好溶解度，能特异性地通过 TLR4/MD2受体激活先天性免疫系统，但同时展现出低细胞毒性，具有作为免疫佐剂的潜力。 [0006]
【主权项】
1. 一种低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A，其特征在于，化学式为 C96H175N2O35P,其结构包含2个a-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸、2个氨基葡萄糖、1个磷酸基 团和5条脂肪酸链，是以0-(1' -6)连接的D-葡萄糖胺二糖为骨架，6'位连接二a-酮 基_3_脱氧-D-甘露辛酸，4'位被磷酸化，2'位氨基连接（R) _3_(十二烷氧基）十四烷基， 3'位、3位和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成。
2. -种产低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的大肠杆菌基因工程菌， 其特征在于，所述基因工程菌的基因型为E.coliW3110AwaaCFAIacIAlpxMlacZ::Fnlp xE〇
3. -种构建权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步 骤： 1) 将人工构建的IacI敲除片段转化入E.coliW3110/pKD46感受态细胞中，获得突变 株E.coliW31101acl: :Pkan，通过Cre酶介导的IoxP位点特异性重组去除卡那霉素抗性基 因； 2. FnlpxE片段电转入步骤1)制备的E.coliW3110AlacI/pKD46感受态细胞中，获得 重组菌，其基因型为E.coliW3110AIacIlacZ: :FnlpxE-Fkan，通过FLP酶介导的FRT位点 的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，构建成中间菌株HWOOl; 3)在HWOOl突变株的基础上转入人工构建的IpxM敲除片段转化入HW001/pKD46感受 态细胞中，获得重组菌E. coli W3110 A IacIlacZ: :FnlpxE IpxM: :Pkan，再次通过Cre酶介 导的IoxP位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，构建成中间菌株HW002 ; 4) 在HW002突变株的基础上将人工构建的waaCF敲除片段转化入HW002/pKD46感受态 细胞中，获得重组菌E.coliHW002waaCF:Pkan，再次通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重 组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，最终基因型为E.CoIiW3110AwaaCFAIpxMAIacI1 acZ: :FnlpxE，构建成基因工程菌株BW002。
4. 一种应用权利要求2所述大肠杆菌基因工程菌生产低毒的、含有五条脂肪酸链的 Kdo2-单磷酸类脂A的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1)摇瓶发酵培养菌体，（2)收 集菌体，氯仿/甲醇/水混合相体系提取分离单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2-类脂，（3) DEAE纤维柱纯化单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2-单磷酸类脂A。
5. 权利要求1所述单磷酸五条脂肪酸链的减毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2_单磷酸 类脂A的应用。
6. 权利要求1所述单磷酸五条脂肪酸链的减毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2_单磷酸 类脂A在制备疫苗佐剂中的应用。
7. 权利要求2所述大肠杆菌基因工程菌在在制备疫苗佐剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备与应用，属于生物工程领域。本发明改造大肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的、五链Kdo2-单磷酸类脂A，这种Kdo2-类脂A分子不连有核心多糖长链、仅由两个2-酮-3-脱氧辛酸、五条脂肪酸链和C4’位单个磷酸构成。该Kdo2-类脂A具有双亲性质，便于分离提取和纯化，能够被实施检测和直接鉴定，且保持了类脂A部分的生物免疫活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是极具发展潜力的疫苗佐剂。同时，本发明提供的提取和纯化该Kdo2-类脂A的方法，步骤简单明了，易于操作。
【IPC分类】C12R1-19, C07H1-06, A61K39-39, C07H13-04, C12P19-26, C12N1-21
【公开号】CN104844665
【申请号】CN201510282822
【发明人】王小元, 王碧雯, 韩亚宁, 李烨, 李颜颜
【申请人】江南大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月28日