一种新的新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物甾醇合成add中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物留醇合成ADD中 的应用，属于微生物基因工程领域。 技术背景
[0002] 留体类药物是仅次于抗生素的一大类药物，广泛应用于抗肿瘤、消炎、抗菌、抗病 毒、抗真菌、抗雌激素、抗惊厥等领域。全球每年对留体类药物的需求量超过100万吨，总价 值超100亿美元。留体药物中间体的合成一般采用微生物转化法。植物留醇作为合成甾体 激素类药物中间体的原料，具有廉价易得，微生物易于降解其侧链等特点。微生物代谢植物 甾醇的主要中间产物有雄甾-4-烯-3, 17-二酮（AD)、雄甾-1，4-二烯-3, 17-二酮（ADD)、 睾酮、宝丹酮、90H-AD等，其中AD和ADD市场需求量最高，因此利用廉价的底物植物甾醇高 效合成AD和ADD具有巨大的商业价值。
[0003] 3-甾酮-A L脱氢酶（KSDD，EC 1. 3. 99. 4)在甾体化合物代谢中具有重要的作用， 它催化AD脱去2个氢生成ADD，同时也可催化90H-AD合成90H-ADD，90H-ADD随后自发打开 母核进而被进一步降解成〇) 2和H20。基因敲除实验已经验证KSDD是留醇代谢过程中关键 酶，敲除KSDD的编码基因将不能获得ADD。目前，由于没有合适的工具一表达载体，利用分 子生物学方法对分枝杆菌进行改造生产ADD比较困难。虽然已有对KSDD同源加强表达的 研宄，但并未给出具体的酶活数据及蛋白表达情况。
[0004] Mycobacterium neoaurum能够降解植物留醇合成激素类药物中间体。M. neoaurum JC-12是本研宄室从土壤中筛选到的菌株，具有降解植物留醇合成AD和ADD的能力。实验 室前期克隆表达出M. neoaurumJC-12的ksdd基因，并对KSDD的转化能力进行了研宄。在 分支杆菌中加强表达KSDD是促进ADD高效生产的一个重要途径，然而，分枝杆菌表达系统 还不完善，缺乏高效表达载体，这已成为目前分枝杆菌降解植物留醇合成药物中间体研宄 中的瓶颈。tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，在大肠杆菌中具有很高 的转录水平，用于钝齿棒杆菌、黄色短杆菌和谷氨酸棒杆菌等阳性菌表达基因也有较高的 表达效率。启动子的结构分析表明启动子包含一个保守的-10区tgngnta(c/t)aatgg和一 个保守性相对较差的-35区，而且在阳性杆菌中启动子-10区对启动子和RNA聚合酶的互 相作用起主要作用，因此本发明设计对tac启动子的-10区序列进行优化。
[0005] 所以，本研宄构建了具有tac启动子的分枝杆菌表达载体，并通过表达绿色荧光 蛋白GFP验证其在M. neoaurum JC-12中的高效表达，为后续在分枝杆菌中高效表达KSDD 奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供：通过启动子替换和启动子-10区序列的优化构建得到一 种新型分枝杆菌表达载体，通过在新金色分枝杆菌过量表达3-留酮-△ ^脱氢酶，高效降 解植物留醇合成药物中间体雄留-1，4-二烯-3, 17-二酮。
[0007] 本发明的技术方案：利用基因工程手段将载体pMF41的启动子pACE替换成tac启 动子构建载体pMTac。通过GFP亮度验证载体pMTac的在新金色分枝杆菌中的表达效果。 对载体pMTac的tac启动子的-10区序列进行优化得到相应的六个新载体，并且通过过量 表达KSDD比较这几个载体在新金色分枝杆菌中的作用。利用新载体过量表达KSDD重组分 枝杆菌的KSDD酶活测定及发酵产物产量也进一步验证了其表达效果。本发明成功构建了 一种金色分枝杆菌表达载体，并构建了一株加强表达3-留酮-A L脱氢酶高效降解植物甾 醇合成药物中间体ADD的分枝杆菌工程菌株，其3-留酮-△ L脱氢酶活力及ADD产量较原 始菌有$父大的提尚。
[0008] 主要试剂：植物留醇（大豆留醇彡95%)购自礼来生物技术（湖州）有限公司； 雄甾-4-烯-3, 17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3, 17-二酮标准样品购于Sigma公司。
[0009] 1.表达载体pMTac的构建及功能验证方法：
[0010] (1)表达载体pMTac的构建
[0011] 根据tac启动子的序列设计引物tac-F和tac-R，以pETac载体为模板，通过PCR 扩增出tac启动子的序列。
[0012] PCR 反应体系：10XExTaq Buffer 5yL，dNTP 4yL，模板 DNA 1 yL，上下游引物 各0. 5 y L，ExTaq酶1 y L，ddH20补齐至总体积50 y L。PCR反应条件：95°C变性3min ;95°C 变性3〇8,60°0复性3〇8,72°0延伸3〇8,30个循环；721：保温5111111。
[0013] PCR产物和质粒pMF41进行Xba I和BamH I双酶切，T4DNA连接酶与16°C连接 纯化后的产物，连接产物转化大肠杆菌JM109,阳性转化子经酶切电泳验证。新载体命名为 pMTac。（2)绿色荧光蛋白表达菌株的构建
[0014] 根据GenBank中登记的绿色焚光蛋白基因gfp设计引物gfp-Fl、gfp-R和gfp-F2， 以PCAMBIA1302为模板，分别以gfp-Fl和gfp-R，gfp-F2和gfp-R为上下游引物，PCR扩增 片段经双酶切后分别连接到同样经双酶切的PMF41和pMTac上，得重组载体pMF41-gfp和 pMTac-gfp。采用电击转化法将空载体及重组载体电转到M. neoaurum JC-12中，用终浓度 为30 y g/mL的固体培养筛选阳性转化子，并提质粒酶切验证。
[0015] (3)重组菌的GFP荧光检测
[0016] 重组菌M. neoaurum JC-12/pMF41-gfp培养至0D6QQ为0?8左右时，加入终浓度为 0.02%乙酰胺诱导，继续培养24h。重组菌M.neoaurumJC-12/pMTac-gfp不需诱导。取重 组菌发酵液，离心收集细胞，50mM Tris-HCl (pH 7. 0)缓冲液洗涤3次，重悬，稀释至适当 浓度取少许于载玻片上，盖上盖玻片，在Nikon ECLIPSE 50荧光显微镜下观察。以原始菌 M. neoaurumJC-12 作为对照。
[0017] 2. 3-留酮-AL脱氢酶加强表达菌株的构建方法：
[0018] (1) 3-甾酉同-AL脱氢酶序列的克隆
[0019] 根据分枝杆菌JC-12的3-留酮-A1-脱氢酶编码基因ksdd设计引物ksdd-Fl、 ksdd-F2和ksdd-R，以分枝杆菌JC-12基因组DNA为模板，进行PCR获得ksdd片段。PCR反 应条件：95°C变性3min ;95°C变性30s，65°C复性90s，72°C延伸3〇8,30个循环；72°0保温 5min。（2)重组质粒 pMF41_ksdd 和 pMTac-ksdd 的构建
[0020] 上述所得ksdd片段经BamH I和EcoR I双酶切，分别连接到同样双酶切pMF41 和pMTac上，得重组载体pMF41_ksdd和pMTac-ksdd。采用电击转化法将重组载体电转到 M. neoaurumJC-12中，用终浓度为30 y g/mL的固体培养筛选阳性转化子，并提质粒酶切验 证。
[0021] (3)3-甾酮-A L脱氢酶的表达及酶活测定
[0022] 重组菌pMF41-ksdd培养至0D6QQ为0. 8左右时，加入终浓度为0. 02%乙酰胺诱 导，继续培养24h。重组菌pMTac-ksdd不需诱导。取重组菌发酵液，离心收集细胞，50mM Tris-HCl (pH 7. 0)缓冲液洗涤3次，重悬，超声波碎细胞，破碎液8000r/min离心30min后 得破碎细胞上清液。12% SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
[0023] 采用PMS-DCPIP法测定KSDD酶活。KSDD脱去底物AD的两个氢生成ADD，蛋白自身 的FAD接受脱去的2H+和2e _成FADH 2，然后FADH^f DCPIP还原，DCPIP在600nm处有吸收 峰。3mL 反应混合物由 100 y L粗酶液、50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 7. 0)、40 y mol/L 的 DCPIP、 1. 5mmol/L的PMS、500 y mol/L AD (溶于2%的甲醇）所组成，检测600nm处的吸光值变化。 酶活单位定义：将在1分钟内还原1 U mol DCPIP所需的酶量定义为一个酶活单位（U)。
[0024] 3. pMTac启动子序列的优化
[0025] (1)几种启动子的-10区序列
[0026] 选择六种不同来源的启动子，通过启动子在线分析（http://www. fruitfly. org) 得到-10区序列。以这六个启动子的-10区序列替换tac启动子的-10区序列设计出六个 启动子分别为tac-1、tac-2、tac-3、tac-4、tac-5以及tac-6,他们与tac启动子的区别仅 在于-10 区序列。启动子 tac、tac_l、tac_2、tac_3、tac_4、tac_5 以及 tac_6 的-10 区序 列及来源如表1。
[0027] 表1几种启动子的-10区序列及来源
[0028] Table lThe-lOregion sequence and resource of promoters
[0029]
【主权项】
1. 一种分枝杆菌表达载体pMTac，其特征是：利用基因工程技术将PMF41的PACE启动 子替换成tac启动子，构建得分枝杆菌表达载体pMTac，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -种分枝杆菌表达载体pMTac-2,其特征是：对权利要求1中载体pMTac的tac 启动子的-10区序列gctcgtataatgt替换为aaagttctaatct，利用基因工程技术构建得 pMTac-2,其核酸序列如SEQ ID N0:2所示。 3. 3-甾酮-Λ L脱氢酶加强表达的重组分枝杆菌，其特征是：通过PCR技术获得3-甾 酮-Λ L脱氢酶编码基因 ksdd，并分别连接到权利要求1中构建的载体pMTac和权利要求 2中构建的载体pMTac-2上，获得重组载体pMTac-ksdd和pMTac-2-ksdd ;将重组载体分别 电转化至M. neoaurum JC-12中，获得KSDD加强表达的重组分枝杆菌M. neoaurum JC-12/ pMTac-ksdd 和 M. neoaurum JC-12/pMTac-2_ksdd〇
4. 利用权利要求3中构建的重组分枝杆菌发酵植物留醇合成AD和ADD，其特征是：菌 株活化48h左右后以接种到含30g/L植物甾醇的发酵罐中，10 %接种量，30°C，400r/min， Ivvm通气量，pH为维持在7. 0-7. 5 ;发酵72h开始流加葡萄糖，维持葡萄糖浓度在4-5g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种新金色分枝杆菌表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明的新金色分枝杆菌表达载体pMTac-2，可用于在新金色分枝杆菌高效表达蛋白，适用于分枝杆菌代谢产物的研究和生产。利用pMTac-2在新金色分枝杆菌中过量表达KSDD，使重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd胞内的KSDD活性比原始菌提高15.12倍。以30g/L植物甾醇为底物，5L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-2-ksdd的ADD产量达到15g/L以上，为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。因此，该表达体系能够有效利用于新金色分枝杆菌的遗传改造。
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-53, C12R1-32, C12P33-02, C12N15-74, C12P33-16
【公开号】CN104830888
【申请号】CN201510143997
【发明人】饶志明, 许正宏, 张乐乐, 张显, 徐美娟, 杨套伟
【申请人】江南大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年3月30日