基于ca125抗原的dc细胞、靶向性免疫细胞群及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及DC细胞、靶向性免疫细胞群及其 制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是人类主要的致死性疾病类型，死亡率居高不下。卫生部最新统计数据 表明恶性肿瘤居我国居民前十位死因首位。2010年中国恶性肿瘤发病患者268万人，死亡 197万人；目前全国共有恶性肿瘤患者600余万人。每年用于恶性肿瘤病人的医疗费用约 占卫生总费用的20%，是全社会最大的医疗负担。目前的治疗手段对于达到治愈、延长恶性 肿瘤患者生存期以及改善生活质量等目标的作用仍然十分有限，尤其对于某些类型的恶性 肿瘤即使是早期诊断也难以获得满意的疗效，至于转移性、全身性或进展期的恶性肿瘤则 更难以治愈。
[0003] 目前的肿瘤治疗策略中，手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而 对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗或免疫疗法进行系统性 治疗。肿瘤发病是多步骤、多基因作用的结果，肿瘤细胞表现出生长、分化与凋亡的失控。临 床上病人症状的多样性和个体遗传异质性，以及肿瘤远处转移病灶的出现，使肿瘤治疗必 须以全身性疾病的观点，采用个体化的综合治疗方案。即根据每个肿瘤病人的特点，采用局 部治疗结合全身治疗；不仅要消除局部病灶的肿瘤，还要控制肿瘤的复发、转移生长及肿瘤 对重要脏器的侵袭，才能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。通常肿瘤局部病灶 的治疗可采取手术和物理治疗（包括射频消融、热疗、放疗、冷冻、超声波及激光治疗等）方 法消除，然而对于影像学不能发现的肿瘤微小病灶（如转移复发灶、局部治疗后的残留病 灶、血液中的癌细胞），以上局部治疗手段则无能为力，必须通过全身性治疗手段加以解决。 由于肿瘤的转移、复发、扩散更为致命，因此全身性治疗显得尤为重要和紧迫。目前全身性 治疗有传统化学治疗、分子祀向药物治疗、生物治疗（包括干细胞移植治疗和免疫细胞治 疗）以及基因治疗等。传统化疗虽然在某些肿瘤治疗方面取得了一些进展，但对延长肿瘤 病人生存期方面仍然贡献不大。而且肿瘤细胞对化疗药的天然耐药和获得性多药耐药以及 化疗毒性，使化学治疗的发展受到了严重的妨碍。多年来的临床实践证明它并非是全身治 疗的优势项目。
[0004] 免疫细胞治疗是近二十年发展起来的，免疫细胞治疗主要包括CIK和DC细胞。由 于它治疗范围广（可用于实体肿瘤及白血病），特别对肿瘤微小病灶（包括转移、复发灶、 血液中的癌细胞）更为有效，无毒副作用，而且适用于肿瘤各阶段（如晚期放、化疗不能使 用）；因此它是全身治疗的一个优势项目。免疫细胞治疗对提高生命质量、延长生存期有显 著的效果，倍受国内外推崇，是目前全身治疗的最佳手段之一，临床潜力巨大。
[0005] 然而，目前用于进行免疫细胞治疗的免疫细胞的制备方法仍有待改进。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种安全、高效的制备DC细胞和靶向性免疫细胞群的方法。
[0007] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0008] 随着生物治疗技术的发展，对恶性肿瘤进行免疫治疗已成为研宄热点，免疫治疗 是肿瘤治疗的一种崭新模式，尤其是细胞介导的过继免疫治疗已较为成熟已经进入临床应 用阶段，并取得了明显的治疗效果。细胞介导的过继免疫治疗已成为肿瘤患者放、化疗后辅 助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具 有良好效果。人们通过研宄淋巴因子一激活的杀伤（LAK)细胞、肿瘤浸润淋巴（TIL)细胞、 细胞因子诱导的杀伤（CIK)细胞等，表明CIK细胞是一种新型、高效、具有广谱杀瘤活性的 非主要组织相容性复合体（MHC)限制性免疫效应细胞，在肿瘤免疫治疗中显露出巨大的应 用价值。树突状细胞OC)是人体内功能强大的主要的抗原递呈细胞，能诱导出抗原特异性 细胞毒淋巴细胞（CTL)反应并可通过直接或间接方式影响0细胞（胰腺的胰岛中能产生 胰岛素的细胞）的增殖，活化体液免疫应答。将CIK细胞和DC联合治疗恶性肿瘤，有助于 解除肿瘤患者的T细胞免疫无能，有协同抗肿瘤的作用。越来越多的试验和临床实践表明 的细胞因子诱导的杀伤细胞联合树突状细胞对恶性肿瘤的治疗（CIK/DC细胞治疗）显示出 良好的治疗效果，有着巨大的发展潜力和应用前景。
[0009] 其中，CTL细胞是⑶8+的T细胞亚群，为一种特异T细胞，对某些病毒、肿瘤细胞 等具有直接杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤的重要防线。CTL杀伤机制 有：①释放穿孔素，颗粒酶，裂解靶细胞。②通过FasL介导靶细胞的凋亡。
[0010] 基于DC的抗原负载技术主要类型有：肿瘤抗原肽冲击DC;肿瘤细胞性抗原冲击 DC;肿瘤细胞RNA冲击DC;基因修饰DC的免疫治疗。发明人发现，肿瘤抗原多肽负载DC是 应用肿瘤抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后回输或免疫接种至荷瘤宿主，能明显诱导机体 产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应，目前所有的dc负载抗原作为疫苗来开发的，在 机体内产生抗体及CTL，没有在体外制备CTL细胞。由于抗原在体内激起的免疫反应有可能 产生系统性字体免疫的可能，发明人利用该技术在体外制备CTL细胞及综合免疫细胞群， 可以解决目前的问题。另外，目前有用各种载体作为抗原，rAAv等病毒类载体负载抗原制 备CTL技术的，ACTL技术就是其中之一，但是由于病毒的整合特性，导致DC细胞的基因组 毒性问题一直解决不了，所以发明人利用mRNA抗原技术替代病毒类或DNA类的载体，从安 全性上超过了病毒类载体，同时从产业化角度上来看，mRNA体外转录更能实现产业化，操作 简单，质控及质检可以标准化。
[0011] 换言之，本发明利用mRNA-DC-CTL技术制备靶向性免疫细胞群，具体地：将肿 瘤相关抗原决定簇的mRNA转染患者的外周血单核细胞（Monocytes)，经细胞因子诱导， 单核细胞转化为具有强大抗原提呈功能的DC细胞。将经此技术获得的DC细胞，在体 外刺激患者的T淋巴细胞，产生有效杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞（CytotoxicT lymphocytes,CTL)。所产生的CTL具有肿瘤抗原特异性，即祀向性，仅针对某种或数种特定 肿瘤相关抗原阳性的肿瘤细胞具有杀伤作用，对抗原阴性的细胞无任何作用。
[0012] 进而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备DC细胞的方法。根据本发 明的实施例，该方法包括以下步骤：将单核细胞进行第一诱导分化培养，以便获得未成熟的 DC细胞；利用CA125抗原mRNA转染所述未成熟的DC细胞，以便获得经过转染的未成熟DC细胞；以及将所述经过转染的未成熟DC细胞进行第二诱导分化培养，以便获得成熟的DC细 胞，其中，所述单核细胞是从样本的外周血单个核细胞中分离获得的。
[0013] 发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够安全高效地制备DC细胞（即树突状细 胞），且本发明的方法成本低、效率高、且能够有效地解决细胞毒性问题，获得的DC细胞回 输患者后安全无毒，能够有效用于免疫细胞治疗，且该DC细胞还能够有效用于刺激同样患 者来源的淋巴细胞产生富含大量CTL细胞的靶向性免疫细胞群，进而用于肿瘤免疫治疗后 效果更好。
[0014] 另外，根据本发明上述实施例的制备DC细胞的方法还可以具有如下附加的技术 特征：
[0015] 根据本发明的实施例，所述CA125抗原mRNA是通过以下步骤获得的：制备CA125 抗原cDNA质粒，所述CA125抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO: 1所示；将所述CA125抗原 cDNA质粒进行线性化处理，以便获得经过线性化处理的CA125抗原cDNA质粒；以及将所述 经过线性化处理的CA125抗原cDNA质粒进行体外转录，以便获得CA125抗原mRNA。由此， 能够有效制备获得CA125抗原mRNA。
[0016] 根据本发明的实施例，以pcDNA3. 1载体为骨架载体，制备所述CA125抗原cDNA质 粒。由此，制备效率高，效果好。
[0017] 根据本发明的实施例，所述pcDNA3. 1载体具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 点。由此，能够有效进行质粒克隆和后续的线性化处理。
[0018] 根据本发明的实施例，基于酶切位点Bstll07I进行所述线性化处理。
[0019] 根据本发明的实施例，利用ITMessage Machine试剂盒进行所述体外转录。由此， 转录效率高、效果好。
[0020] 根据本发明的实施例，在进行所述体外转录后，进一步包括除杂纯化的步骤。由 此，有利于后续CA125抗原mRNA转染的进行。
[0021] 根据本发明的实施例，利用电转或PEI法进行所述转染。由此，转染效率高、效果 好。
[0022] 根据本发明的实施例，利用PEI法进行所述转染，其中，PEI与所述CA125抗原 mRNA的混合质量比为3:1。由此，转染效果突出。
[0023] 根据本发明的实施例，利用DC培养基进行所述第一诱导分化培养和所述第二诱 导分化培养。由此，能够有效诱导获得DC细胞。
[0024] 根据本发明的实施例，所述DC培养基包含：无血清细胞培养基；100~1000U/ml 的CTL4因子；以及2体积％~10体积％的自体血清，其中，所述血清来源于所述样本。由 此，培养效果好。根据本发明的实施例，所述无血清培养基为Takara的无血清培养基。根 据本发明的另一些实施例，所述无血清培养基中添加有0. 5体积％~5体积％的抗生素，优 选庆大霉素。由此，培养效果突出。
[0025] 根据本发明的实施例，进行所述第一诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次。 根据本发明的实施例，进行所述第二诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次。由此，培 养效果好。
[0026] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备靶向性免疫细胞群的方法。根 据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：提供样本的外周血单个核细胞；将所述样本的 外周血单个核细胞分离为淋巴细胞和单核细胞；将所述淋巴细胞进行活化培养，以便获得 经过活化培养的淋巴细胞；将单核细胞进行第一诱导分化培养，以便获得未成熟的DC细 胞；利用CA125抗原mRNA转染所述未成熟的DC细胞，以便获得经过转染的未成熟DC细胞； 将所述经过转染的未成熟DC细胞进行第二诱导分化培养，以便获得成熟的DC细胞；以及将 所述成熟的DC细胞与所述经过活化培养的淋巴细胞进行混合培养，以便获得靶向性免疫 细胞群。
[0027] 发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效制备获得靶向性免疫细胞群，该 靶向性免疫细胞群不仅具有强大杀伤特定肿瘤细胞的CTL细胞，还有CIK、NK等免疫细胞， 能够有效用于免疫细胞治疗。此外，本发明的方法成本低、效率高，且能够有效地解决细胞 毒性问题，获得的靶向性免疫细胞群回输患者后安全无毒。
[0028] 根据本发明的实施例，所述CA125抗原mRNA是通过以下步骤获得的：制备CA125 抗原cDNA质粒，所述CA125抗原cDNA的核酸序列如SEQIDNO: 1所示；将所述CA125抗原 cDNA质粒进行线性化处理，以便获得经过线性化处理的CA125抗原cDNA质粒；以及将所述 经过线性化处理的CA125抗原cDNA质粒进行体外转录，以便获得CA125抗原mRNA。由此， 能够有效制备获得CA125抗原mRNA。
[0029] 根据本发明的实施例，以pcDNA3. 1载体为骨架载体，制备所述CA125抗原cDNA质 粒。由此，制备效率高，效果好。
[0030] 根据本发明的实施例，所述pcDNA3. 1载体具有BamhI、Xbal和Bstll07I酶切位 点。由此，能够有效进行质粒克隆和后续的线性化处理。
[0031] 根据本发明的实施例，基于酶切位点Bstll07I进行所述线性化处理。
[0032] 根据本发明的实施例，利用ITMessageMachine试剂盒进行所述体外转录。由此， 能够有效进行质粒克隆和后续的线性化处理。
[0033] 根据本发明的实施例，在进行所述体外转录后，进一步包括除杂纯化的步骤。由 此，有利于后续CA125抗原mRNA转染的进行。
[0034] 根据本发明的实施例，利用电转或PEI法进行所述转染。由此，转染效率高、效果 好。
[0035] 根据本发明的实施例，利用PEI法进行所述转染，其中，PEI与所述CA125抗原 mRNA的混合质量比为3:1。由此，转染效果突出。
[0036] 根据本发明的实施例，所述活化培养包括：利用CTL1细胞培养基对所述淋巴细胞 进行第一活化培养24小时；利用CTL2细胞培养基对经过第一活化培养的淋巴细胞进行第 二活化培养2-3天；以及利用CTL3细胞培养基对经过第二活化培养的淋巴细胞进行第三活 化培养4-5天，每隔2-3天等量补液一次。由此，能够有效使淋巴细胞活化，有利于后续靶 向性免疫细胞群的获得。
[0037] 根据本发明的实施例，所述CTL1细胞培养基包含：无血清细胞培养基；
[0038] 100~1000U/ml的CTL1因子；以及2体积％~10体积％的自体血清，所述CTL2 细胞培养基包含：无血清细胞培养基；100~l〇〇〇U/ml的CTL2因子；以及2体积％~10体 积％的自体血清，所述CTL3细胞培养基包含：无血清细胞培养基；100~1000U/ml的CTL3 因子；以及2体积％~10体积％的自体血清，其中，所述血清来源于所述样本。由此，活化 培养效果好。根据本发明的实施例，所述无血清培养基为Takara的无血清培养基。根据本 发明的另一些实施例，所述无血清培养基中添加有0. 5体积％~5体积％的抗生素，优选庆 大霉素。由此，活化培养效果突出，淋巴细胞活化效果好，有利于后续靶向性免疫细胞群的 获得。
[0039] 根据本发明的实施例，利用DC培养基进行所述第一诱导分化培养和所述第二诱 导分化培养。由此，能够有效诱导获得DC细胞。
[0040] 根据本发明的实施例，所述DC培养基包含：无血清细胞培养基；100~1000U/ml 的CTL4因子；以及2体积％~10体积％的自体血清，其中，所述血清来源于所述样本。由 此，培养效果好。根据本发明的实施例，所述无血清培养基为Takara的无血清培养基。根 据本发明的另一些实施例，所述无血清培养基中添加有0. 5体积％~5体积％的抗生素，优 选庆大霉素。由此，培养效果突出。
[0041] 根据本发明的实施例，进行所述第一诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次。 根据本发明的实施例，进行所述第二诱导分化培养4-5天，每2-3天半换液一次。由此，培 养效果好。
[0042] 根据本发明的实施例，利用CTL3细胞培养基进行所述混合培养6-8天，优选7天。 由此，能够有效获得靶向性免疫细胞群。
[0043] 根据本发明的实施例，所述CTL3细胞培养基包含：无血清细胞培养基；100~ 1000U/ml的CTL3因子；以及2体积％~10体积％的自体血清，其中，所述血清来源于所述 样本。由此，培养效果好。根据本发明的实施例，所述无血清培养基为Takara的无血清培 养基。根据本发明的另一些实施例，所述无血清培养基中添加有〇. 5体积％~5体积％的 抗生素，优选庆大霉素。由此，能够高效地制备获得靶向性免疫细胞群。
[0044] 根据本发明的实施例，按照所述成熟的DC细胞与所述经过活化培养的淋巴细胞 的体积比为1 :20进行所述混合培养。由此，混合培养效果好，能够高效地制备获得靶向性 免疫细胞群。
[0045] 此外，根据本发明的另一些实施例，本发明的制备靶向性免疫细胞群的方法还可 以包括以下步骤：
[0046] 第一步：抽取肿瘤患者静脉外周血（50-100毫升）或采用血细胞分离机直接分离 出外周血单个核细胞（PBMC)。
[0047] 第二步：经培养，PBMC被分离为淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞继续培养，备用； 利用CA125抗原mRNA转染单核细胞，并利用细胞因子诱导成熟的树突状细胞（DC)产生。
[0048] 第三步：将成熟的DC细胞与淋巴细胞混合培养，将淋巴细胞诱导成为具有抗原特 异性的、杀伤抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞，获得靶向性免疫细胞群。
[0049] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种靶向性免疫细胞群。根据本发明的 实施例，其是通过前面所述的制备靶向性免疫细胞群的方法制备获得的。发明人发现，本发 明的靶向性免疫细胞群不仅具有强大杀伤特定肿瘤细胞的CTL细胞，还有CIK、NK等免疫细 胞，且成本低、安全无毒，能够有效用于免疫细胞治疗。
[0050] 根据本发明的再一方面，本发明还提供了靶向性免疫细胞群、以及利用前面所述 的制备DC细胞的方法制备获得的DC细胞在制备药物中的用途，所述药物用于抑制肿瘤转 移、扩散、复发。
[0051] 根据本发明的实施例，所述肿瘤为CA125抗原阳性肿瘤，优选乳腺癌。
[0052] 需要说明的是，发明人发现，由于mRNA无需启动子，不能无限制的扩增，不会进入 细胞核插入宿主细胞染色体上，无遗传基因毒性，具很高的安全性等特点，因而本发明拟用 mRNA-DC-CTL方法制备DC细胞以及靶向性免疫细胞群（针对CA125的靶向性免疫细胞集 群），以便用于肿瘤的免疫治疗。本发明的方法突破了以往的刺激DC的药物不能常规制备 的局限性。并且，在体外利用mRNA转染DC而产生特异性多靶点CTL细胞的属于第一次。
[0053] 具体地，本发明的方法具有以下优点的至少之一：
[0054] 1、国际上首次构建出CA125mRNA抗原。
[0055] 2、国际上首次利用CA125抗原mRNA转染DC细胞来体外诱导获得CA125特异性的 靶向免疫细胞群（富含CTL细胞）。
[0056] 3、本发明的靶向免疫细胞群包含：CTL细胞（CD8+，CD3+CD8+CD28+)，CIK细胞 (⑶3+⑶56+)，NK细胞（⑶3-⑶56+)，使其不仅具有强大杀伤特定肿瘤细胞的CTL细胞，还有 CIK、NK等免疫细胞，可以提升患者的整体免疫力，明显改善患者的症状，能帮助免疫反应更 加完整、效能更尚。
[0057] 4、靶向免疫细胞群制备的整个过程仅需要12-14天。
[0058] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0059] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0060] 图1显示了根据本发明一个实施例，CA125抗原cDNA质粒构建过程中质粒酶切鉴 定的结果；
[0061] 图2显示了根据本发明一个实施例，GFP检测mRNA转染后效果的结果图；
[0062] 图3显示了根据本发明一个实施例，基于靶向性免疫细胞群的流式细胞仪检测结 果获得的统计分析结果。
【具体实施方式】
[0063] 需要说明的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说 明，"多个"的含义是两个或两个以上。
[0064] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或 仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公 司。
[0065] 实施例1 :
[0066] -、材料与设备
[0067] 1、实验室级别：GLP
[0068] 2、仪器设备：
[0069] 负80度超低温冰箱（中科美菱，DW-HL388);普通冰箱（海尔，双开门，-20°C 和4°C);霉菌培养箱（上海博迅，MJX-160B-Z);恒温水浴箱（SSW-420-2S) ;C02培养箱 (HF240);低速离心机（上海安亭，TDL-40C);倒置生物显微镜（科信，型号：BLD-1);生物 安全柜（苏州净化，双人）；电动移液器（德国普兰德）l-l〇ml;微量移液枪（大龙）1套，4 把；程序降温盒（Thermo);液氮罐（金凤，YDS-120-216) ;PCR仪；凝胶电泳成像系统；电泳 仪；恒温仪；
[0070] 3、细胞培养耗材：
[0071] 细胞培养袋〇^1?^1公司）；75〇112培养瓶、175〇11 2培养瓶、1.81111冻存管、1.51111￡? 管、50ml离心管、15ml离心管，均来自美国Coning公司；0? 22um针头滤器（美国BD公司）； lOOum细胞筛网（美国BD公司）；30ml注射器（上海医疗器械）。
[0072] 4、细胞培养试剂：
[0073] 无血清细胞培养基（Takara，货号：GT-T561);澳大利亚胎牛血清（FBSQUALIFIED AUSTRALIAORIGIN)，Gibco,货号：10099-141 ;
[0074] 淋巴细胞分离液Ficoll液（GE，货号：17-1440-02);
[0075]青霉素/链霉素双抗溶液（PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL，PS)，Gibco,货号： 15140-122。
[0076] 5、培养基的配制：
[0077]5. 1试剂：
[0078]CTL1因子（包括y干扰素，1000U/ml) :1ml，-20°C长期保存，4°C保存2周；
[0079]CTL2 因子（包括IL-l，1000U/ml;IL-2，1000U/ml;CD3 抗体，100ng/ml;CD28 抗体， lOOng/ml) :1ml，-20°C长期保存，4°C保存 2 周；
[0080] CTL3 因子（包括IL-2，1000U/ml;IL-7,20ng/ml;IL-15,20ng/ml) :1ml，-20°C长 期保存，4°C保存2周；
[0081] CTL4 因子（包括GM-CSF，1000U/ml;IL-4, 500U/ml;TNF-a，500U/ml;IL