棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病害领域，具体涉及棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPRl作为抗 棉花黄萎病菌靶标基因的应用。
【背景技术】
[0002] 植物病害是影响作物生产乃至全球粮食安全的重要因素，而真菌是其中重要的一 大病原物类群。加强病原真菌的致病机制和寄主抗病机制的研宄，寻求控制真菌病害的新 途径成为科学研宄的重要任务和热点。而对病原真菌基因功能的研宄是解决上述问题的关 键之一 〇
[0003] 大丽轮枝菌（VerticilliumdahliaeKleb)引起的棉花黄萎病是一种世界性真菌 病害，是世界各主要产棉国家和地区普遍发生和危害最严重的病害之一。每年给棉花生产 造成巨大损失，迄今为止尚无有效的防治办法。棉花黄萎病为土传维管束病害，防治困难， 难以找到很好的抗源材料，因而多年来一直未能培育出高抗黄萎病的棉花新品种。研宄开 发的病害防治方法和药剂亦难以达到理想的防治效果。尽管黄萎病对棉花生产造成的经济 损失不容低估，但有关致病的分子机制方面的研宄报道还很有限。
[0004] 应用生物信息学方法分析大丽轮枝菌VdLs. 17基因组序列发现，含有大量的编码 碳水化合物活性酶类（Carbohydrate-activeen-zymes)如果胶酶、纤维素酶和分泌蛋白， 这可能是大丽轮枝菌能够在广泛的寄主植物上定殖的重要原因之一。
[0005]TALL-PCR能够快速有效地获得T-DNA插入位点侧翼序列，已经被用于大丽轮枝菌 突变体侧翼染色体DNA序列的分离。深入研宄棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌与寄主植物互 作的分子机制，为控制黄萎病的发生奠定了基础。
[0006] 微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和黄萎病的初侵染菌源，在病害循 环中起重要作用，当植物组织坏死或者早衰时，形成的微菌核与在土壤中潜伏或者二次侵 染有关，其形成的数量及存活情况直接影响黄萎病的发生为害程度。因此，明确微菌核形成 与萌发机制对于深入研宄棉花黄萎病病害流行规律和制定防治措施具重要意义。
[0007] 细胞壁作为植物的第一道物理屏障，在防御病原菌方面起重要作用。病原菌若成 功侵染植物，必须要突破这一道屏障。大丽轮枝菌在侵染寄主植物时产生各种细胞壁降解 酶，如果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等，这些细胞壁降解酶能降解寄主植物的细胞壁，打破寄主 的物理屏障，有利于病原菌的定殖、传播和症状的扩展，细胞壁降解酶在大丽轮枝菌致病中 作为毒力因子而起作用。
[0008] 分泌蛋白是一类带有信号肽结构能够转运到胞外的生物大分子，通常具有酶活性 或者与其它因子（自身/外界）互作而发挥功能，如碳水化合物酶类、效应物等，大丽轮枝 菌分泌的胞外蛋白（复杂的糖蛋白化合物）是引起寄主萎蔫并最终发病的一个重要因素。 因此，大丽轮枝菌的胞外蛋白是引起棉花产生黄萎病的重要因素之一。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是克隆了一个来源于棉花黄萎病菌的、在致病性、黑 色素积累、微菌核产生和纤维素酶、蛋白酶活性中起重要作用的，且为新的分泌蛋白基因 VdPRl，通过鉴定该基因为防治棉花黄萎病害提供药物靶标。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供了棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPRl作为 抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用，其中，所述棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPRl的核苷 酸序列为SEQIDN0:1。
[0011] 本发明克隆了棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPRl(PathogenicityRelated Gene)，其来自大丽轮枝菌（VerticilliumdahliaeKleb)，该基因的核苷酸序列为SEQID NO: 1，该基因的0RF序列具有SEQIDNO: 2所示的核苷酸序列。
[0012] 本发明同时提供了上述基因VdPRl编码的蛋白质序列，该蛋白质序列具有SEQID N0:3所示的氨基酸序列，其中SEQIDN0:3所示的第1位至第19位序列为信号肽序列。
[0013] 本发明通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突变体库，获得 了致病力减弱的突变菌株vdprl。Southern杂交证实该突变菌株为T-DNA单插入突变体。 借助TAIL-PCR技术和VdLs. 17的基因组数据库，获得了T-DNA插入的侧翼序列，并从野生 型菌株Vd080中成功克隆得到了致病相关基因VdPRl。
[0014] 本发明构建了VdPRl敲除载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入野生型菌株 Vd080,得到基因缺失突变体AVdPRl;在敲除突变体AVdPRl中重新导入VdPRl基因，获得 互补突变体AVdPRl-C。
[0015] 本发明对敲除突变体AVdPRl和互补突变体AVdPRl-C的菌落形态、生长速率、胞 外酶活性以及致病力进行测定，并和野生型的各项指标进行比较分析。结果表明：敲除突变 体AVdPRl微菌核和黑色素产量明显降低，在不同碳源（蔗糖、脱脂奶粉、纤维素、淀粉）的 培养基上生长速率也发生了变化，其中在纤维素为唯一碳源的培养基上降低了 21 %，在脱 脂奶粉为唯一碳源的培养基上降低了 15%。致病力测定结果表明，敲除突变体AVdPRl的 致病力也显著降低，棉株的病情指数仅为野生型的41 %，降低了 59%。因此，确定VdPRl基 因是棉花黄萎病菌致病相关基因，关联微菌核的产生、黑色素的积累，对纤维素酶、蛋白酶 的活性起到促进作用。
【附图说明】
[0016] 图1:A:突变菌株vdprl的southern杂交检测；B:VdPRl基因结构和T-DNA插入 位置示意图；
[0017] 图2:互补突变体AVdPRl-C绿色荧光观察；
[0018] 图3 :VdPRl基因转录水平的测定，A:敲除突变体AVdPRl;B:互补突变体 AVdPRl-C；
[0019] 图4:突变体菌株在PDA培养基上的菌落形态；
[0020] 图5 :突变体菌株在不同碳源（蔗糖、脱脂奶粉、纤维素、淀粉）培养基上生长示意 图；
[0021] 图6 :突变体的致病力测定（A、C:野生型Vd080和突变体侵染的棉花表型；B、D:病 情指数）。
[0022] 棉花黄萎病菌（Virticilliumdahliae)菌株Vd080,于2012年3月15日保存于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研宄所，100101)，其保藏编号是：CGMCCNo. 5904。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1 :VdPRl基因的分离和克隆
[0024] 通过对强致病力棉花黄萎病菌菌株Vd080 (保藏号：CGMCCNo. 5904的T-DNA插入 突变体库进行致病力测定，筛选获得了致病性显著降低的突变体vdprl。Southern杂交证 实该突变体是T-DNA单拷贝插入，利用TAIL-PCR和VdLs. 17基因组数据库，获得致病相关 基因VdPRl。
[0025] 1.ISouthern杂交确定突变体vdprlT-DNA插入拷贝数
[0026] 根据T-DNA上大小约为500bp的潮霉素片段序列设计Southern杂交探针引物 HygP-F/R。低致病力突变体vdprl的基因组DNA5ng，NEBbuffer10uL，BamHI3uL，补 水至100yL。37°C消化5h，之后，65°C水浴10min，终止酶切反应。探针制备、DNA变性、转 移、杂交及显色方法按照试剂盒说明书进行。
[0027] 以T-DNA上的潮霉素区段做探针的Southernblot结果表明，探针在低致病力突 变体vdprl基因组上只有一个杂交信号。说明T-DNA在突变体VdPRl中为单拷贝（图1A)。
[0028] 1. 2TAIL-PCR技术获得VdPRl的基因信息
[0029] 根据双元载体pCTHyg(建ATMT库所用）的T-DNA左臂（LB)和右臂（RB)内侧 DNA序列，分别设计 3 '和 5 '步移引物R-SP1、R-SP2、R-SP3 和L-SP1、L-SP2 和L-SP3， GenomeWalking试剂盒提供的简并引物API、AP2、AP3和AP4,步移引物与随机引物成对 作为模板扩增T-DNA左右臂侧翼序列，引物序列见表1。所用反应程序及反应体系均按照 GenomeWalking试剂盒的方法进行。反应结束后，取上述第一轮、第二轮、第三轮的反应产 物于1 %的琼脂糖凝胶电泳上检测。分别回收3'端和5'端第三轮TAIL-PCR特异