一种利用耐热β-葡萄糖苷酶及其突变体进行虎杖苷生物转化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体说涉及一种耐热0-葡萄糖苷酶突变体N223T、 G224F和N223T/G224F，以及该酶及其突变体在虎杖苷转化为白藜芦醇中的应用。 技术背景
[0002] 白藜芦醇是一种活性多酚类物质具有抗氧化、抗自由基作用，对造成动脉粥祥硬 化和血栓形成的各种氧化反应起抑制作用，白藜芦醇已被列为抗心血管抗癌最有前途的药 物之一。白藜芦醇多存在于藜芦、虎杖和葡萄皮中，通常其含量较低，如干燥虎杖根茎中白 藜芦醇含量仅为〇. 1% -0.2%，而虎杖苷的含量明显高于白藜芦醇，约为2%左右。研宄发 现，糖苷形式的虎杖苷和牛蒡子苷不具有最佳的生理活性状态，须在0 _葡萄糖苷酶的作 用下转化成甙元形式的白藜芦醇和牛蒡子苷元才能被吸收而发挥药效。因此，若将虎杖苷 转化成白藜芦醇，会大大提高白藜芦醇生产得率，提高其生物利用率，降低成本。目前制 备白藜芦醇的方法主要有：酸、碱水解方法和酶水解法。由于酸碱的应用存在对甙元破坏 性大，污染大，目的性差等缺点，因此，酶水解法以其具有高效、安全、生态和环保等特点是 大白藜芦醇和牛蒡子苷元制备的理想途径。陈雪香等人公开一种白藜芦醇生物转化菌进行 白藜芦醇生物转化的方法（CN201210188784);向极钎等人公开一种从虎杖中酶法制备高 纯度白藜芦醇的方法（CN201210432150);李志平等人公开了一种高纯度白藜芦醇的制备 方法即将原料药材虎杖粉碎经乙醇抽屉后添加复合酶制剂进行酶解获得高纯度白藜芦醇 (CN201310725682);黄黎锋人公开一种新的水解虎杖苷制备白藜芦醇的葡萄糖苷酶、 编码基因、载体、工程菌及其应用（CN201210017857);林元山等人公开一种利用微生物菌 株棘孢曲霉（Aspergillus.aculeatusCGMCCNo. 3876)及其发酵制备的复合酶进行生物转 化白藜芦醇苷为白藜芦醇的方法（CN200910234069)。尽管相关专利申请较多，但是仍未能 很好解决转化时间长，酶作用底物特异性不高，收率低以及成本高的问题。
[0003]酶的热稳定性直接关系到酶的使用寿命，从而决定酶的应用效率和酶的价值。极 端嗜热袍菌属Thermotoga所产的0-葡萄糖苷酶（Tm-BglA)属于水解酶家族1，在95°C下 保温6h仍保留60%活性，具有极高的耐热性，其在生物转化中具有减少污染危险、加快反 应速度、提高酶作用底物溶解度和较高的抗化学变性等优点，同时可实现高底物浓度的热 水抽提与酶水解并存的生物转化工艺，极具工业应用潜力。但是野生型Tm-BglA水解作用 的底物范围广，包括纤维二糖、乳糖、水杨苷、熊果苷、烷基糖苷、对硝基苯酚-D-葡萄糖 苷和对硝基苯酚-0 -D-果糖苷、对硝基苯酚--D-半糖乳糖苷、黄豆苷、染料木苷、丙二酰 黄豆苷、丙二酰染料木苷、昆布二糖和槐糖，若能提高Tm-BglA对虎杖苷转化为白藜芦醇的 底物特异性，将会大大提高虎杖苷和牛蒡苷的转化效率，降低反应副产物，进而提高白藜芦 醇的产量与纯度，降低生产成本。
[0004] 科学研宄表明：游离形式的白藜芦醇水溶性最差，基本不溶于水，而葡萄糖苷型的 虎杖苷易溶于热水，在60-95°C时其溶解度随着温度的升高而显著增加，因此。本发明针对 此特性，将耐热e-葡萄糖苷酶用于虎杖苷原料的热抽提取工艺中，进行边抽提边转化，使 得虎杖苷一旦从固相原料中溶出即被去糖基进而转化为白藜芦醇，这样用80 %乙醇直接提 取离心所得沉淀即可得到白藜芦醇。因耐高温葡萄糖苷酶稳定性高，所得残液中酶残 余活性和有效成分可回用。
【发明内容】
[0005] 本发明通过对极端嗜热袍菌属（Thermotiga)的家族1的|3-葡萄糖苷酶Tm-BglA 与纤维四糖进行分子对接，以及Tm-BglA的苷元结合位点预测，选择位于Tm-BglA蛋白结构 中第五折叠股上的两个氨基酸（N223和G224)进行单突变和双突变，分别将位于223 位和224位上的天冬酰胺（N)和甘氨酸（G)分别替换成苏氨酸（T)和苯丙氨酸（F)，获得突 变基因，然后插入表达质粒并转化宿主获得重组工程菌，令其表达，获得0 _葡萄糖苷酶突 变体N223T、G224F和N223T/G224F，进一步将这些耐热0 -葡萄糖苷酶及其突变体水解虎 杖苷后，酶解产物经高效液相色谱检测分析发现：水解10_20min后突变酶N223T和G224F 对虎杖苷转化为白藜芦醇的效率分别提高了 41. 65%和25. 87% ; 0 -葡萄糖苷酶及其突 变体N223T和G224F转化虎杖苷为白藜芦醇单位每小时转化率分别达到92. 1 %、96. 2 %、 93. 7%〇
[0006] 本发明公开了耐热葡萄糖苷酶及其突变体在虎杖苷转化为白藜芦醇中的应 用，所述的耐热0 -葡萄糖苷酶是指来源热袍菌属Thermotiga的糖苷水解酶家族113 -葡 萄糖苷酶TbglA;耐热0 -葡萄糖苷酶突变体是N223T、G224F和N223T/G224F，氨基酸序列 如SEQ:IDNO. 1、IDNO. 2 和IDNO. 3 所示。
[0007] 本发明还提供了一种虎杖苷生物转化制备白藜芦醇的方法，是以利用上述耐热 0-葡萄糖苷酶及其突变体水解虎杖苷底物得到白藜芦醇。
[0008] 具体的方法是：向虎杖苷底物中加入pH为4. 2-7. 5的磷酸钠-柠檬酸缓冲溶液， 料液比为1:2-1〇&/1^);加入0-葡萄糖苷酶及其突变体，其添加量为1〇〇-1〇〇(^/^底物， 混合均匀后于60-95°C下低速搅拌反应5min-2h，取反应液于4-10°C和4000rpm-8000rpm下 离心10-20min，取沉淀物备用，上清液用作下批提取的配料用水；向沉淀物中加入3-10倍 体积且浓度为75 % -100 %乙醇进行边搅拌边提取，然后抽滤去渣，滤液进一步经真空浓缩 得到白藜芦醇产品。
[0009] 本发明通过定点突变获得高活性水解虎杖苷制备白藜芦醇的0-葡萄糖苷酶的 突变体N223T、G224F和N223T/G224F，并对其进行高效表达，进一步经破细胞、热处理和离 心分离所得到的0-葡萄糖苷酶及突变体的粗酶液对虎杖苷水解获得组分单一的白藜芦 醇产物，这不仅排除了供体菌共生的其他一系列酶系的干扰，而且相对其野生型酶，水解虎 杖苷的活性分别得到显著提高，具有转化效率高，转化时间短且反应副产物少，产物分离和 纯化容易，得到的白藜芦醇产物量大且纯度高等优点。
【附图说明】
[0010] 图1纯化0 -葡萄糖苷酶及突变体N223T、G224F和N223T/G224F的SDS-PAGE图 谱? 1:野生型Tm-BglA，2 :N223T，3 :G224T，4 :N223T/G224F
[0011] 图2Tm-BglA及突变体N223T和G224F对虎杖苷转化为白藜芦醇的水解进程（在 80°C和pH6. 2 下反应 2min、5min、10min、20min、60min)
[0012] 图3Tm-BglA(B:野生型）及突变体N223T(C)和G224F(D)转化虎杖苷制备白藜 芦醇产品的HPLC图谱（在80°C和pH6. 2下反应60min，A:未加酶）?
[0013] 色谱条件：仪器：AgilentHPLC-1100型高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent Z0RBAX-C18(4. 6X150mm，5ym);检测器：UVdetector;检测波长：303nm;柱温：30°C;流速： 1.OmL/min;流动相：A相为甲醇，B相为0. 05%磷酸-水溶液。进样量为10yL。以保留时 间定性，以峰面积定量，以外标法计算。标准样品购于上海国药集团化学试剂有限公司。其 中，保留时间3. 2min为虎杖苷，保留时间4. 5min为白藜芦醇。
[0014] 梯度程序：
【主权项】
1. 耐热e-葡萄糖苷酶及其突变体在虎杖苷转化为白藜芦醇中的应用，其特征在于所 述的耐热0 -葡萄糖苷酶是指来源热袍菌属Thermotiga的糖苷水解酶家族113 -葡萄糖苷 酶TbglA;耐热0 -葡萄糖苷酶突变体是N223T、G224F和N223T/G224F，氨基酸序列如SEQ: IDNO. 1、IDNO. 2 和IDNO. 3 所示。
2. -种虎杖苷生物转化制备白藜芦醇的方法，其特征在于，以虎杖苷为底物，在耐热 0 -葡萄糖苷酶及其突变体的作用下通过酶解法制得白藜芦醇；所述的耐热e-葡萄糖苷 酶是指来源热袍菌属Thermotiga的糖苷水解酶家族113 -葡萄糖苷酶TbglA;耐热|3 -葡 萄糖苷酶突变体是N223T、G224F和N223T/G224F，氨基酸序列如SEQ:IDNO. 1、IDNO. 2和 IDNO. 3 所示。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征是，向虎杖苷底物中加入pH为4. 2-7. 5的磷酸 钠-柠檬酸缓冲溶液，料液比为1:2-10g/mL;加入0 -葡萄糖苷酶及其突变体，其添加量为 100-1000U/g底物，混合均匀后于60-95°C下低速搅拌反应5min-2h，取反应液于4-10°C和 4000rpm-8000rpm下离心10-20min，取沉淀物备用，上清液用作下批提取的配料用水；向沉 淀物中加入3-10倍体积且浓度为75 % -100 %乙醇进行边搅拌边提取，然后抽滤去渣，滤液 进一步经真空浓缩得到白藜芦醇产品。
【专利摘要】本发明公开了一种耐热β-葡萄糖苷酶的突变体N223T、G224F和N223T/G224F在虎杖苷转化为白藜芦醇的应用。一种耐热β-葡萄糖苷酶的突变体N223T、G224F和N223T/G224F，氨基酸序列如SEQ：ID NO.1、ID NO.2和ID NO.3所示；利用本发明的耐热β-葡萄糖苷酶及其突变体水解虎杖苷制备白藜芦醇，相对其野生型酶，具有转化效率高，反应副产物少，产量和纯度高，分离纯化容易、化学污染少等优点。
【IPC分类】C12N9-42, C12P7-22
【公开号】CN104818262
【申请号】CN201510203484
【发明人】薛业敏, 候静静
【申请人】南京师范大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月24日