表位标记用抗体、杂交瘤细胞株以及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于目的蛋白质的检测或纯化的表位（印Hope)标记系统，更 详细的说，涉及一种源自作为耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的感光蛋白质 (photoreceptor protein)的细菌光敏色素（Bacteriophytochrome，BphP)的新型肽标签， 以及能够特异地识别上述肽标签的抗体及能够产生上述抗体的杂交瘤细胞株。并且，本发 明还涉及编码上述肽标签的多核苷酸；涉及包括上述多核苷酸的载体或转化体；以及包括 上述肽标签的融合蛋白质及用于制备、检测或纯化上述融合蛋白质的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 有用的蛋白质或多肽可通过合成产生或者可以从天然供给源中分离。但是，这种 方法存在在费用、时间方面并不经济，且生产量有限的缺点。因此，优选通过对重组制备的 转化体进行培养而生产目的蛋白质和目的多肽，其中上述重组是为使目的蛋白质或目的多 肽过表达而进行的。但是，在细胞环境中产生的多肽（特别是短的多肽）由于存在于细胞 的蛋白酶的作用而易降解（degradation)，而且，并不是所有目的蛋白质都有抗体，因此不 易纯化没有对应抗体的目的蛋白质。
[0003] 为了克服这些问题使用了蛋白质标记或表位标记。蛋白质标记（protein tagging)或者表位标记（epitope tagging)是制备将表位标记的编码序列连接于目的蛋 白质的编码序列的重组核酸分子后，使其在合适的宿主细胞中表达，再利用对应于表位标 记的抗体对目的蛋白质进行检测、定量、纯化或在目的蛋白质的细胞内追踪位置，功能鉴定 等的一种重组DNA方法。商业上有很多表位标签和作为其相应配体的抗体，当选择合适抗 体的表位标签和其对应的抗体时，能够使用蛋白质印迹分析（Western blot analysis)， 免疫沉淀（immunoprecipitation)，免疫焚光（immunof luorescence)，免疫细胞化学 (immunocytochemistry)，免疫亲和纯化(immunoaffinity purification)等方法对目的蛋 白质进行检测或纯化，因此可以消除对目的蛋白质产生抗体的必要性。
[0004] 目前使用于蛋白质标记（protein tagging)或者表位标记（epitope tagging)的 表位标签有从六个氨基酸残基程度的短肽标签（例如，6X组氨酸（Histidine，His)标签） 至40kDa程度大的蛋白质（例如，MBP)的很多独特的标记[参见Ste Vens，R.C.，（2000) Structure Fold Des 8: R177-85]，而一般会使用由3至30个氨基酸构成的肽标签。His-标 记的蛋白质在Ni-NTA (镍-次氮基三乙酸）的树脂上被特异性地捕获，且其可以通过EDTA 或咪唑被洗脱下来。除此之外，麦芽糖结合蛋白质（MBP) (396个氨基酸，40kDa)、金黄色葡 萄球菌蛋白质A、^调蛋白质结合肽（CBP) (26个氨基酸，2. 96kDa)、绿色焚光蛋白质（Green Fluorescent Protein，GFP) (238 个氨基酸，27kDa)及谷胱甘肽-S-转移酶（GST) (211 个氨 基酸，26kDa)也可用于原核生物及真核生物蛋白质的检测或纯化。并且，通常最常用的表 位标签有c-myc标签，HA标签，FLAG标签等。c-myc标签是源于人的c-myc蛋白质的长度 为 10 个氨基酸的表位标签[Evans et al·，（1985)Mol. Cell. Biol.，12:3610-3616]，HA 标 签是源自流感病毒血凝素 （influenza hemagglutinin)HA-I蛋白质的长度为9个氨基酸的 表位标签[Field et al·，（1988)Mol.Cell.Biol· ,8:2159-2165]，FLAG 标签是源自噬菌体 T7 的长度为 8 个氨基酸的表位标签[Hopp et al·，（1988) Bio/Technology，6:1204-1210]。
[0005] 另外，对于进行表位标记时所使用的表位标签，应优选使用当其与目的蛋白质融 合时，对目的蛋白质的三维结构和生物活性影响最小的表位标签。一般长度长的表位标签 (例如GST标签或者MBP标签）会存在改变目的蛋白质的功能等的问题。相反，长度相对较 短的表位标签，例如，FLAG标签、c-myc标签等，几乎不影响与其融合的目的蛋白质的特性， 且能够与其对应的抗体高度特异地结合，并且，有些时候不需要从融合蛋白质中去除，因此 是现在主要使用的表位标签。但是，对于c-myc标签和FLAG标签的氨基酸序列，迄今为止已 知的生物体的细胞内的蛋白质中大多数的蛋白质含有相同的序列，从而可能会诱导识别标 签的抗体的非特异性反应，而这种非特异性抗体反应会妨碍对特定目的蛋白质的分离及确 认，因此存在会降低试验的可靠性的问题[Ksenija Gasic et al·，（2005)Plant molecular biology reporter23:9-16]。为了克服这种非特异性反应的问题，曾开发过在蛋白质的 N-末端连续融合两个不同的标签后使用的亲和纯化系统[Rigaut，G.，et al. (1999)Nat Biotechnol 17:1030-2]〇
[0006] 因此，需要开发一种新型肽标签以及可与其配对使用的抗体。上述新型肽标签以 及可与其配对使用的抗体可以克服现有技术中利用表位标签及其对应的抗体对在重组宿 主细胞内表达的融合蛋白质进行检测及纯化时存在的问题，即可以克服非特异性反应，同 时具有较短的氨基酸序列。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的抟术问题
[0008] 本发明的所要解决的一个技术问题在于，提供一种对检测或者纯化目的蛋白质有 效的新型肽标签，以及其用途。
[0009] 本发明所要解决的另一个技术问题在于，提供一种能够特异地识别新型肽标签或 能够与新型肽标签选择性结合的新型抗体，能够产生上述抗体的杂交瘤细胞株及其用途。
[0010] 抟术方案
[0011] 本发明的发明人在为了开发对目的蛋白质的检测或者纯化有用的肽标签及相对 应抗体而进行研宄的过程中，使用耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的感光蛋白 质细菌光敏色素（Bacteriophytochrome，BphP)或者其片段作为免疫原，获得产生单克隆 抗体的杂交瘤，其中上述耐辐射球菌为异养细菌。同时，利用产生的抗体，以耐辐射球菌 (Deinococcus radiodurans)的细菌光敏色素（Bacteriophytochrome，BphP)为对象进行 了表位鉴定（epitope mapping)，发现了由9个氨基酸构成的表位，从而完成了本发明。
[0012] 为解决上述一个目的，本发明提供一种肽标签，其包含由SEQ ID NO :1的氨基酸序 列构成的肽或者由SEQ ID NO :2的氨基酸序列构成的肽，作为抗体的识别部位或抗体的结 合部位。另外，本发明提供一种编码上述肽标签的多核苷酸。此时，编码上述肽标签的多核 苷酸优选包括SEQ ID NO :7的碱基序列或者SEQ ID NO :8的碱基序列。另外，编码上述肽 标签的多核苷酸可通过具有SEQ ID NO :16的碱基序列的正向引物和具有SEQ ID NO :17的 喊基序列的反向引物构成的引物对，或者由具有SEQ ID NO :32的喊基序列的正向引物和具 有SEQ ID NO :33的碱基序列的反向引物构成的引物对合成。此外，本发明提供含有编码上 述肽标签的多核苷酸的重组载体。此时，上述重组载体可以是克隆载体或者表达载体。另 外，上述表达载体其特征在于，优选可还包括编码目的蛋白质的目的多核苷酸，上述目的多 核苷酸与编码肽标签的多核苷酸连接。此外，本发明提供包含目的蛋白质及与其连接的肽 标签的融合蛋白质。此时，构成上述融合蛋白质的肽标签包含由SEQ ID NO :1的氨基酸序 列构成的肽或者由SEQ ID NO :2的氨基酸序列构成的肽，作为抗体的识别部位或者抗体的 结合部位。另外，本发明提供一种编码上述融合蛋白质的多核苷酸。此外，本发明提供一种 转化体，其特征在于，该转化体导入有选自编码上述肽标签的多核苷酸、包含编码上述肽标 签的多核苷酸的重组载体、编码上述融合蛋白质的多核苷酸、以及包含编码上述融合蛋白 质的多核苷酸的重组载体中的任意一种。并且，本发明提供一种融合蛋白质的检测方法，其 包括：使上述融合蛋白质与对应于肽标签的抗体相接触并结合的步骤；以及确认结合于上 述抗体的融合蛋白质的存在或对其量进行分析的步骤。此时，上述融合蛋白质可通过导入 有编码融合蛋白质的多核苷酸或者包括其的重组载体的转化体进行表达。此外，上述抗体， 其特征在于，其优选为由保藏号为KCTC 12283BP的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。此 外，本发明提供一种蛋白质的纯化方法，其包括：使上述融合蛋白质与对应于肽标签的抗体 接触并结合的步骤；以及回收结合于上述抗体的融合蛋白质的步骤。此时，上述融合蛋白 质可通过导入有编码融合蛋白质的多核苷酸或者包括其的重组载体的转化体进行表达。此 外，上述抗体，其特征在于，其优选为由保藏号为KCTC 12283BP的杂交瘤细胞株产生的单 克隆抗体。另外，本发明提供融合蛋白质检测或者纯化用试剂盒，其包括：选自编码上述肽 标签的多核苷酸、用于合成编码上述肽标签的多核苷酸的引物对、包括编码上述肽标签的 多核苷酸的重组载体、编码上述融合蛋白质的多核苷酸及包括编码上述融合蛋白质的多核 苷酸的重组载体中的任意一个；以及选自能够与由SEQ ID NO :1氨基酸序列构成的肽或者 由SEQ ID NO :2氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗体，或者产生上述抗体的杂交瘤细胞 株中的任意一个。此外，上述抗体，其特征在于，其优选为由保藏号为KCTC12283BP的杂交 瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0013] 为解决上述另一目的，本发明提供对应于由SEQ ID NO :1的氨基酸序列构成的肽 或者SEQ ID NO :2的氨基酸序列构成的肽的一种抗体。此时，上述抗体特征在于，其优选为 单克隆抗体。此外，上述单克隆抗体特征在于，其为重链同种型（isotype) IgG 2a或者轻链 同种型κ (kappa)。此外，本发明提供产生上述抗体的杂交瘤细胞株。此时，上述杂交瘤细 胞株特征在于，其保藏号为KCTC 12283BP。另外，本发明提供包括上述抗体或者上述杂交 瘤细胞株的试剂盒。此时，上述抗体特征在于，其固定于支撑体（support)。此外，上述试 剂盒优选可包括上述抗体（对应于由SEQ ID NO :1的氨基酸序列构成的肽或者由SEQ ID NO :2的氨基酸序列构成的肽的抗体）的检测手段。上述检测手段优选为二抗，该二抗能够 与对应于由SEQ ID NO :1氨基酸序列构成的肽或者由SEQ ID NO :2氨基酸序列构成的肽 的抗体结合。此外，上述二抗优选能够与选自酶、放射性物质或者荧光物质中的标记物质偶 联（conjugate)。此外，上述试剂盒可以用于融合蛋白质的检测或者纯化，其中上述融合蛋 白质包括目的蛋白质及与其连接的由SEQ ID NO :1的氨基酸序列构成的肽或者由SEQ ID NO :2的氨基酸序列构成的肽。
[0014] 有益效果
[0015] 根据本发明的新型肽标签具有短的长度的同时，具有能够消除现有的c-myc标签 及FLAG标签等的非特异性反应的优点。因此，利用根据本发明的新型肽标签及其对应的抗 体时，能够非常有效地检测或者纯化重组细胞内表达的融合蛋白质。并且，包括根据本发明 的新型肽标签及与其对应的抗体的表位标记系统可以适用于特定蛋白质的细胞内定位，功 能鉴定，检测，纯化，以及研宄蛋白质间的相互作用等的各种领域中。
【附图说明】
[0016] 图1是表示利用His标签柱层析法对DrBphP及DrBphN进行纯化的结果的附图。 图1中的A是概略地表示用于表达耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的BphP蛋白质 及BphN蛋白质的基因构建体的模式图（全长（FL) (1-755氨基酸，BphP) ; Λ PHY/HKD (1-321 氨基酸，BphN))。图1中的B表示利用Ni+-NTA亲和层析法对耐福射球菌（Deinococcus radiodurans)的BphP脱辅基蛋白质（Apoprotein)及BphN脱辅基蛋白质进行纯化，并与胆 绿素（BV) -起培养20分钟后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，再通过锌（zi