一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明特别是涉及一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用，属于基因工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 叶酸是人体必不可少的营养物质，其主要生物学功能是作为甲基供体参与细胞 内的甲基化反应和脱氧核糖核酸的合成，叶酸不能被人体直接利用，必需通过一系列活化 才能发挥其生理功能，而从食物中摄取的叶酸只有在叶酸还原酶的作用下还原为四氢叶 酸，才能参与人体许多重要的生化代谢反应，叶酸缺乏是导致胚胎发育异常的环境因素之 一。研宄表明，人群中叶酸缺乏会导致胎儿先天性异常，特别是神经管畸形（Neural tube defectsNTDs)的发生，也可以导致其他出生缺陷的发生率，例如先天性心脏病、唇腭裂、以 及唐氏综合征等，并可使胚胎发生严重多发畸形，导致胚胎在发育早期即死亡，此外，叶酸 缺乏还可以引起早产、流产等不良妊娠的发生。男性缺乏叶酸可以降低精子数量和活力。
[0003] 在孕妇中大力推广"叶酸强化"，从某种程度上可减少出生缺陷的发生。孕妇一般 采用每天服用一粒叶酸片（400微克）的形式补充叶酸，对于叶酸利用能力正常的孕妇这个 用量是充足的，但对于叶酸代谢异常的孕妇却远远不够。此外，最近发现"叶酸强化"还存 在一定负面效应，大范围人群大量补充叶酸，人为地造成未来的人口对于大量维生素产生 依赖性，由此，可能导致人口整体的基因组成发生变化，这种人群对于某些致命的疾病将变 得十分脆弱。因此，鉴别出叶酸利用能力正常和叶酸利用能力不足的人群，个性化合理的补 充叶酸具有重要的现实意义和长远意义。
[0004] 部分叶酸利用能力不足的孕妇，其叶酸代谢途径相关酶基因发生了突变，导致了 酶分子一个氨基酸的替换，使酶活性大大下降而影响叶酸的利用能力。已经报道叶酸代谢 途径中一些酶基因的多态性与神经管畸形、心血管疾病、唐氏综合征、流产、淋巴细胞性白 血病、乳腺癌、胃癌、Andesophageal肿瘤、阿尔茨海默病等疾病相关联。
[0005] 在叶酸利用能力相关的基因检测技术临床应用之前，妇产科医师通常只能建议所 有孕妇按照标准量、标准时间来服用叶酸。
[0006] 目前，传统基因突变检测方法包括：单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)、PCR-限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、变性高效液相色谱（Denaturing High Performance Liquid Chr〇mat〇graphy，DHPLC)、荧光定量PCR法（含融解曲线法）、直接测序、基因芯片等。这些 方法或者检测能力有限、或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是，除基因芯片外， 这些方法难以针对不同基因的多个突变位点同时进行高通量检测。而基因芯片技术平台成 本昂贵，对环境和人员素质要求高，难以在我国广大医疗机构中普及，因此有必要建立一种 高通量、高效能、低成本的叶酸代谢相关酶基因突变筛查方法，以实现临床快速检测和规模 化筛查。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种叶酸需求遗传检测试剂 盒，其包括：
[0008] 以 CBS 基因的 699C>T 位点、DHFR基因的 c. 594+59de 119 位点、GST01 基因的 428C>A 位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的677C>T位点、 MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c. 56+781A > C位点 和66A>G位点、NFE2L2基因的insl+11108C>T位点、N0S3基因的894G>T位点、RFC1基因的 80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象而设计 的PCR扩增引物和延伸引物，其中，
[0009] 所述检测CBS基因的699C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 1与SEQ ID No. 2 所示，
[0010] 所述检测DHFR基因c. 594+59dell9位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 3与SEQ ID No. 4 所示，
[0011] 所述检测GST01基因的428C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 5与SEQ ID No. 6所示，
[0012] 所述检测MTHFD基因1958G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 7与SEQ ID No. 8 所示，
[0013] 所述检测MTHFR基因1298A>C位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 9与SEQ ID No. 10所示，
[0014] 所述检测MTHFD基因677C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 11与SEQ ID No. 12所示，
[0015] 所述检测MTR基因2756A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 13与SEQ ID No. 14 所示，
[0016] 所述检测MTR基因的-186T>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 15与SEQ ID No. 16所示，
[0017] 所述检测MTR基因的905G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 17与SEQ ID No. 18所示，
[0018] 所述检测MTRR基因66A>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 19与SEQ ID No. 20 所示，
[0019] 所述检测MTRR基因c. 56+781A > C位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 21与SEQ ID No. 22 所示，
[0020] 所述检测NFE2L2基因insl+11108C>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 23与 SEQ ID No. 24 所示，
[0021] 所述检测N0S3基因的894G>T位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 25与SEQ ID No. 26所示，
[0022] 所述检测RFC1基因80G>A位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 27与SEQ ID No. 28 所示，
[0023] 所述检测TCN2基因776C>G位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 29与SEQ ID No. 30 所示，
[0024] 所述检测TYMS基因1494del6位点的扩增引物序列如SEQ ID No. 31与SEQ ID No. 32所示，
[0025] 以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。
[0026] 其中，所述PCR反应试剂包括dNTP、5X和10XPCR缓冲液、Mg2+离子、FastTaq酶、 SNaPshot Mix混合液。还包括主要由SAP酶、Exon I酶与配套缓冲液组成的纯化试剂。还 可包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照标本和/或阴性对照标本。
[0027] 进一步地，以CBS基因的699C>T位点、DHFR基因的c. 594+59dell9位点、GST01基 因的428C>A位点、MTHFD基因的1958G>A位点、MTHFR基因的1298A>C位点、MTHFD基因的 677C>T位点、MTR基因的-186T>G位点，905G>A位点和2756A>G位点、MTRR基因的c. 56+781A > C位点和66A>G位点、NFE2L2基因的insl+11108C>T位点、N0S3基因的894G>T位点、RFC1 基因的80G>A、TCN2基因776C>G和TYMS基因1494del6等十六个基因突变位点为检测对象 而设计的延伸引物分别如SEQ ID No. 33~SEQ ID No. 48所示。
[0028] 本发明的另一目的在于提供前述任一项的试剂盒在中国人群的叶酸利用能力基 因突变筛选中的应用。
[0029] 本发明的又一目的在于提供一种叶酸利用能力基因突变筛选方法，包括：
[0030] (1)提供前述任一项所述叶酸需求遗传检测试剂盒，
[0031] (2)以所述扩增引物对叶酸代谢基因进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
[0032] (3)以所述延伸引物针对步骤⑵所获纯化产物进行延伸标记反应和二次纯化；
[0033] (4)对步骤（3)所获二次纯化产物进行毛细管电泳，并对毛细管电泳结果进行数 据采集和分析，获得筛查结果。
[0034] 本发明的又一目的在于提供一种检测系统，其包含本发明所述试剂盒。
[0035]与现有技术相比，本发明的优点在于：该试剂盒能针对目前中国人群叶酸利用能 力相关基因突变的特点，选择覆盖范围广泛的16个突变热点作为筛查目标，弥补目前现有 突变筛查方法的不足，提供了一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的叶酸利 用能力基因突变筛查方法。
【附图说明】
[0036] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037] 图1为本发明具体实施例中的SNaPshot实验流程示意图；
[0038] 图2为本发明具体实施例中的毛细管电泳结果图，其中，电泳顺序由左向 右依次为：MTHFR 677C>T、MTR 905G>A、MTHFD 1958G>A、MTR-186T>G、MTR 2756A>G、 NFE2L2insl+11108C>T、MTRR 66A>G、CBS 699C>T、RFC180G>A、GST01428C>T、N0S3894G>T、 MTHFR 1298A>C、DHFR c.594+59dell9、MTRR 56+781A>C、TCN2776C>G、TYMS 1494del6(理 论上的片段长度分别为 32bp，25bp、30bp，28bp，35bp，37bp，40bp，42bp，45bp，49bp， 50bp, 51bp，54bp, 56bp, 60bp和61bp。实际电泳过程存在飘移现象，即与分子量标记所测片 段大小有一定差距，如32bp的野生型MTHFR 677C片段会飘移到25bp的MTR 905G>A片段 左面，32bp的突变型MTHFR 677T会在33bp的MTR 2756A>G片段右侧，但不会影响整体结果 判读）。
【具体实施方式】
[0039] 本发明的一实施方案之中提供了一种叶酸需求遗传检测试剂盒及其应用，它能针 对目前中国人群叶酸代谢相关基因突变的特点，