一种创伤弧菌快速检测试剂盒的利记博彩app
【专利说明】
[0001]
技术领域： 本发明涉及一种利用环介导等温扩增（LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体 是一种创伤弧菌快速检测试剂盒。
[0002]
【背景技术】： 创伤弧菌（Vibrio Vulnificus)是一种广泛分布于亚热带浅海水域及海产品如贝类、 虾、蟹等，气候温暖的六月至十月，海中此类淡菌浓度高。创伤弧菌是革兰氏阴性菌，具移动 性、弯曲的杆菌，单独存在或尾端连扬戊"C"或者"S〃型。对酸吐敏感，pH6以下就不生长。 目前已发现100多种，其中至少4种会致病。创伤弧菌的感染造成临床上的病症有两种： 1、原发吐败血症（primary septicemia)此由肠胃感染引起的，是由于吃入生的或未煮熟的 鱼虾类或生蚝，病人会有发热、恶心、呕吐、皮肤病变、坏死胜溃烂及败曲一症休克等症状。 创伤弧菌可放出强烈毒素进入血液，将引起败血病及体克，诱发全身器官衰竭导致死亡，死 亡率高达50%以上，如果因而休克，死亡率更是在百分之九十以上；2、伤口感染（infected wound)慢性肝炎患者或者免疫力弱的人，若皮肤有伤口又接触到含有病菌的海水或被虾、 蟹类刺伤，就有可能被创伤弧菌感染。感染该菌种的初期，在感染部位有肿胀、红斑、进而形 成水泡，之后伤口溃烂蔓延，创伤弧菌会入侵筋膜和肌肉的间隙，出现组织坏死或严重的蜂 窝性组织炎，然后病菌沿着间隙直上继续感染。创伤弧菌感染病情发展快速，通常脚趾头蔓 延到大腿只需一到两天时间。有时候甚至需要截肢来阻止感染蔓延，如果不幸很可能引发 次发性败血症造成死亡，死亡率约为24%。
[0003] 在LAMP反应中，不需要通过热变性将双链DNA变成单链，因为双链DNA在65°C左 右处于动态平衡状态，任伺一条引物与双链DNA的互补链部位进行碱基互补配对延伸时， 另一条链就会脱落成为单链。
[0004] LAMP的原理：环介导等温扩增技术是2000年由日本Notomi T等人研发的核酸扩 增方法，其原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase )，在恒温条件（65°C左右）保温约lh，即可完成核酸扩增反应，扩 增出LAMP特征性梯状条带，并可通过设计两条环引物使反应速度提升1/2~1/3。在DNA延 伸合成时，从脱氧核酸三磷酸基质（dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结 合，产生焦磷酸镁衍生物，呈现白色沉淀，只需肉眼观察即能判断扩增与否；亦可用结合双 链DNA的荧光染料SYBR GreenI染色，在紫外灯或日光照射透视下呈现强荧光。如果含有 扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。
[0005] LAMP的优点：环介导等温扩增技术具有以下优点：（1)特异性强：4条引物（或6 条引物）对靶序列的6个特异序列区的识别，受非靶序列的影响小，保证了 LAMP扩增的高 度特异性；（2)敏感性高：检测限更低，仅为6个拷贝，高于PCR法；（3)快速：在lh内可将 靶序列扩增至10 9~101CI倍，产率可达到0.5 m g/mL。向反应体系中添加2条环引物（Loop Primers )，可进一步提高LAMP反应的速度，缩短反应时间：（4)操作简便：不需PCR仪和特 殊试剂，只需一恒定温度，即能扩增目标基因，模板也不需要热变性。扩增产物不需繁琐的 电泳，肉眼即可判断。加入逆转录酶，还可进行RT LAMP，完成针对RNA病毒的扩增；（5)实 时定量：可克服常规PCR只能定性检测的不足。可见，LAMP有利于在一些基层机构的应用和 大规模样品的检测，为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持，在食品卫生质量检验、 临床疾病诊断及微阵列基因芯片的开发等领域具有广阔的应用前景。
[0006] 因海洋创伤弧菌的危害性和快速发病的特点，需要快速进行检测。为了加快反应 的速度，将常规的LAMP法检测创伤弧菌进行优化，选择了适宜的引物，通过两种表面活性 剂的作用，增加反应组分的有效接触面积，加快反应的进行。试剂组分中加入与聚合酶等量 的水解酶（UNG酶)，可以有效将扩增反应时间控制在30分钟，比常规检测检测方法用时（50 分钟）要短，加快了临床的检测时间，增强了 LAMP法检测创伤弧菌的应用性。
【发明内容】
[0007] 针对创伤弧菌检测试剂盒（LAMP法)检测时间较长的问题，本发明提供了一种创伤 弧菌快速检测试剂盒（LAMP法)。本发明优化了组分，通过调整表面活性剂和加入UNG酶的 作用，加快了检测的时间，增强了试剂的临床检测应用。
[0008] 本试剂盒包括以下组分及含量的试剂： (1) 10X反应缓冲液 2.5yL (2) dNTP Mixture 10mM each 3. 5 y L (3) 表面活性剂 甜菜喊 5mmol/L 2 y L AEO-9 5mmol/L 2 y L (4) MgS04 150mmol/L 1 y L (5) Bst 酶 16KU/mL 0. 5 y L (6) UNG 酶 16KU/mL 0. 5 y L (7) 染料 妈黄绿素4mmol/L 1 y L (8) 去离子水 4yL (9) FIP 引物 20umol/L 2 y L BIP 引物 20umol/L 2 y L F3 引物 5 umol/L 1 y L B3 引物 5 umol/L 1 y L ； (10) 阳性对照 DNA lOumol/L; 用两条外引物扩增出创伤弧菌vvhA基因后，取其片段（217bp)重组入质粒所得。
[0009] 所述10 X反应缓冲液包含以下含量的组分： Tris-HCl 缓冲液 PH 8.8 200mM KC1 100mM (NH4)2S04 100mM MgS04 20mM Triton X-100 1% ； 所述FIP引物的碱基序列如下： 5' AATCCGCGTCCCAGGCTTTCCTGACGCCAACGCCTTCCGTT' 3 (SEQ ID N0:1) BIP引物的喊基序列： 5' AGCGTGTCCAGTCCGTCTAGCGCCAGTGCCCACAGGTCGTG' 3 (SEQ IN NO :2) F3引物的喊基序列： 5' CAACGTCACCATGGGCGTTA ' 3 (SEQ ID NO : 3) B3引物的喊基序列： 5' GCTTTAGAAGTCTTATGACC ' 3 (SEQ ID NO : 4) 本试剂盒使用过程的主要步骤如下： 1、取各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存。
[0010] 2、预混溶液的配制(请在冰上进行） (1) 反应按照下表比例进行配制（1次反应量）
【主权项】
1. 一种检测创伤弧菌的快速试剂盒，其特征在于，包括以下含量及体积的试剂： (1)IOX反应缓冲液 2.5yL (2) dNTPMixtureIOmMeach 3. 5uL (3) 表面活性剂 甜菜喊 Smmol/],2yL AE0-9 5mmol/L 2yL (4) MgSO4 150mmol/LIyL (5) Bst酶 16KU/mL 0. 5 yL (6) UNG酶 16KU/mL 0. 5 yL (7) 1?黄绿素 4mmol/LIyL (8) 去离子水 4yL (9) FIP引物 20umol/L 2yL BIP 引物 20umol/L 2 yL F3引物 5umol/LIyL B3引物 5umol/LIyL; (10)阳性对照DNAIOumol/L； 所述IOX反应缓冲液包含以下含量的组分： Tris-HCl 缓冲液 PH8.8 200mM KCl IOOmM (MM)2SO4IOOmM MgSO4 20mM TritonX-100 1% ； 所述FIP引物的碱基序列如SEQIDNO: 1所示； 所述的BIP引物的碱基序列如SEQINNO:2所示； 所述的F3引物的碱基序列如SEQIDNO:3所示； 所述的B3引物的碱基序列如SEQIDNO:4所示。
【专利摘要】本发明提供了一种创伤弧菌的快速检测试剂，本发明通过优化试剂组分，调整了表面活性剂的组分，同时加入水解酶UNG酶的方式，加快了反应速度，在较短的时间内，达到与常规检测方法等效的程度，这大大缩短了临床检测的应用时间，同时未影响临床结果的判断，能够快速的获得准确检测结果，对于海洋创伤弧菌的检测具有很大的临床应用价值。
【IPC分类】C12Q1-04, C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104789680
【申请号】CN201510201466
【发明人】胡成进, 侯亚兰, 谭柏清
【申请人】胡成进
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月24日