一种青蛤酶解多肽的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及一种青蛤酶解多肽的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 青蛤（Cyclina sinensis)属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科，俗称黑蛤、圆 蛤、铁蛤等，分布于我国沿海潮间带的泥砂滩中，是我国沿海地区常见的一种贝类。青蛤肉 质鲜美、营养丰富，除有较高的食用价值之外还是一种重要的海洋药物，《神农本草经》、《本 草纲目》以及《本草纲目拾遗》均将青蛤作为一种常用药物收录在其中。
[0003] 近年来对海产品的酶解多肽研宄较多，如：专利号为ZL201010253745. 0(授权公 告号为CN 102372765 B)的中国发明专利《菲律宾蛤仔酶解多肽的制备方法》公开了一种菲 律宾蛤仔酶解多肽（Asp Trp Pro His)的制备方法，同时还公开了该酶解多肽的应用。目 前研宄表明，青蛤肉提取物能增加老年大鼠脾中的淋巴细胞、巨噬细胞活性及淋巴结中的 巨噬细胞活性，对提高细胞免疫应答及机体正常免疫力等有重要的作用；粗青蛤多糖在体 外具有抗氧化活性，对四氯化碳诱导的小鼠肝毒性模型具有重要的保护作用，但关于青蛤 酶解多肽的研宄目前未见报道，尤其是青蛤酶解多肽在抗氧化活性方面的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种青蛤酶解多肽的 制备方法。
[0005] 本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供上述青蛤酶解多肽在 抗氧化活性方面的应用。
[0006] 本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种青蛤酶解多肽的制备方 法，
[0007] 其特征在于包括以下步骤：
[0008] (1)取新鲜的青蛤，去壳取内脏，用匀浆机破碎，得青蛤内脏匀浆液；
[0009] (2)在上述匀浆液中按1:3~4的比例加入蒸馏水，用一定浓度的盐酸和氢氧化钠 溶液调节匀浆液的pH值至9~11，加入1000~2000u/g碱性蛋白酶，40~50°C酶解4~ 8h，沸水灭活10~15min ;
[0010] (3)将灭活后的酶解液冷却至室温，9000~10000r/min离心10~15min，取上清 液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥得青蛤酶解多肽。
[0011] 作为优选，所述步骤（2)中酶解温度为50°C，酶解时间为4h，碱性蛋白酶添加量为 2000u/g，酶解 pH 为 9。
[0012] 作为优选，所述青蛤酶解多肽的分子量为15~25KDa。
[0013] 本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：上述青蛤酶解多肽在抗氧化活 性产品中的应用。
[0014] 进一步，所述抗氧化活性为对自由基的清除作用、对Fe2+离子的螯合作用、还原能 力以及对PBR322DNA损伤的保护作用。
[0015] 再进一步，所述的自由基为羟基自由基和DPPH自由基，所述pBR322DNA损伤由羟 基自由基诱导。
[0016] 再进一步，所述青蛤酶解多肽浓度为1. 57mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到 50%，所述青蛤酶解多肽浓度为5mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到91. 24% ;所述青 蛤酶解多肽浓度为2. lmg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到50%，所述青蛤酶解多肽浓度 为5mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到62. 83% ;青蛤酶解多肽对Fe2+离子的螯合能力 的EC50为2. 75mg/mL，且青蛤酶解多肽浓度为5mg/mL时，螯合力为61. 13%;所述青蛤酶解 多肽的还原能力与其浓度呈正相关，且还原力为0.331。
[0017] 上述方案中的抗氧化活性产品可为食品、药品、保健品以及化妆品。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点在于：青蛤是一种常见的海产贝类，以新鲜青蛤为 原料酶解提取青蛤酶解多肽，原材料来源广，成本低，操作方便，并且提取的青蛤酶解多肽 具有较好的抗氧化活性，其中对DPPH自由基的清除率可高达91. 24%，对羟自由基的清除 率可达62. 83 %，对Fe2+的螯合力为61. 13 %，还原力为0? 331，并且对由羟自由基诱导损伤 的PBR322DNA有一定的保护作用，可广泛应用于抗氧化活性产品中。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例2中青蛤酶解多肽对DPPH自由基的清除率示意图；
[0020] 图2为实施例3中青蛤酶解多肽对羟自由基的清除率示意图；
[0021] 图3为实施例4中青蛤酶解多肽对Fe2+离子的螯合作用示意图；
[0022] 图4为实施例5中青蛤酶解多肽的还原力示意图；
[0023] 图5为实施例6中青蛤酶解多肽抗羟自由基诱导pBR322DNA损伤能力的琼脂糖凝 胶电泳图；
[0024] 图6为实施例7中青蛤酶解多肽的SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0026] 下述各实施例中使用的原料和试剂如下：
[0027] 新鲜青蛤购于舟山南珍市场，去壳取内脏，-20°C冷冻保存备用；碱性蛋白酶购于 北京亚太恒信生物科技有限公司；邻二氮菲、DPPH、铁氰化钾购自上海晶纯试剂有限公司； 其余试剂为分析纯均购置国药集团化学试剂有限公司。
[0028] 仪器如下：
[0029] BSA1245型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；CF16RX高速冷冻离心机（日 立公司）；UV-1600PC型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；SSW型微电脑电热恒 温水槽（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DYCZ-28C型电泳仪（北京六一仪器厂）。
[0030] 实施例1 :酶解制备青蛤酶解多肽
[0031] 取上述青蛤内脏作为原料，将原料用匀浆机破碎，得青蛤内脏匀浆液。在上述匀 浆液中按1:3~4的比例加入蒸馏水，用一定浓度的盐酸和氢氧化钠溶液调节匀浆液的pH 值，加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解结束后沸水灭活10~15min。将灭活后的酶解液冷却至 室温，9000~10000r/min离心10~15min，取上清液旋转蒸发浓缩，冷冻干燥得青蛤酶解 多肽。
[0032] 如表1所示，考虑酶解过程中的四个因素：1温度、2时间、3加酶量、4pH，对酶解 效果的影响，每个因素选取三个水平进行正交实验，比较碱性蛋白酶在不同水解条件下的 DPPH自由基清除率（具体过程参见实施例2)，从而确定碱性蛋白酶的最佳水解条件。
[0033] 表1碱性蛋白酶因素与水平
【主权项】
1. 一种青蛤酶解多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 取新鲜的青蛤，去壳取内脏，用匀浆机破碎，得青蛤内脏匀浆液； (2) 在上述匀浆液中按1:3~4的比例加入蒸馏水，用一定浓度的盐酸和氢氧化钠溶液 调节匀浆液的pH值至9~11，加入1000~2000u/g碱性蛋白酶，40~50°C酶解4~8h， 沸水灭活10~15min; (3) 将灭活后的酶解液冷却至室温，9000~lOOOOr/min离心10~15min，取上清液旋 转蒸发浓缩，冷冻干燥得青蛤酶解多肽。
2. 如权利要求1所述的青蛤酶解多肽的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤 (2)中酶解温度为50°C，酶解时间为4h，碱性蛋白酶添加量为2000u/g，酶解pH为9。
3. 如权利要求1或2所述的青蛤酶解多肽的制备方法，其特征在于，所述青蛤酶解多肽 的分子量为15~25KDa。
4. 一种如权利要求1所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性产品中的应用。
5. 如权利要求4所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性产品中的应用，其特征在于，所述 抗氧化活性为对自由基的清除作用、对Fe2+离子的螯合作用、还原能力以及对pBR322DNA损 伤的保护作用。
6. 如权利要求5所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性产品中的应用，其特征在于，所述 的自由基为羟基自由基和DPPH自由基，所述pBR322DNA损伤由羟基自由基诱导。
7. 如权利要求6所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性产品中的应用，其特征在于，所述 青蛤酶解多肽浓度为I. 57mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到50%，所述青蛤酶解多肽 浓度为5mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到91. 24% ; 所述青蛤酶解多肽浓度为2.lmg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到50 %，所述青蛤酶 解多肽浓度为5mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到62. 83% ;青蛤酶解多肽对Fe2+离子 的螯合能力的EC50为2. 75mg/mL，且当青蛤酶解多肽浓度为5mg/mL时，螯合力为61. 13%; 所述青蛤酶解多肽的还原能力与其浓度呈正相关，且还原力为〇? 331。
8. 如权利要求4~7中任一权利要求所述的青蛤酶解多肽在抗氧化活性产品中的应 用，其特征在于，所述抗氧化活性产品为食品、药品、保健品以及化妆品。
【专利摘要】本发明涉及一种青蛤酶解多肽的制备方法，由新鲜青蛤，取内脏，匀浆后的匀浆液，在匀浆液加入碱性蛋白酶进行酶解，将酶解液离心取上清液，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥得青蛤酶解多肽，该青蛤酶解多肽的分子量为15～25KDa。该青蛤酶解多肽具有较好的抗氧化活性，其中对DPPH自由基的清除率可高达91.24％，对羟自由基的清除率可达62.83％，对Fe2+的螯合力为61.13％，其还原力为0.331，并且对由羟自由基诱导损伤的pBR322 DNA有一定的保护作用，可广泛应用于抗氧化活性产品中。
【IPC分类】C12P21-06
【公开号】CN104789626
【申请号】CN201510099953
【发明人】杨最素, 丁国芳, 潘欣, 赵莎莎, 赵玉勤, 闫海强
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月6日