一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及线性直链肽的制备方法，特别涉及一种含有24个氨基酸残基的线性 直链肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 艾滋病是以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，自其被发现以来，已严 重威胁人类的生存，对全球人口健康和社会经济的发展产生巨大的影响。伴随着多年来的 研宄，艾滋病在治疗上取得了很大的进展，譬如高效抗逆转录病毒治疗（Highlyactive antiretroviraltherapy,HAART,又称为"鸡尾酒"疗法）的应用。鸡尾酒疗法是通过多种 的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病，根据此方法的基本原理，针对HIV1的膜融合抑制 剂采用分子生物学手段重组和表达并设计出组合多肽即PY-24和FY-24,该两条多肽针对 HIV的gp41，和gpl20的靶点，在前期的实验中证明了它们可对HIV1具有非常好的抑制活 性。
[0003]PY-24是一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽，它的分子式是ClltlH17具6028，分 子量：2444. 81，多肽序列为H-Pro-His-Ser-Gly-Ala-His-Gly-Ile-Pro-Lys-Ile-Phe-Gly -Ala-Arg-Ala-Gln-Pr〇-Ala-Ala-Ala-Arg-Ala-Tyr-〇H，结构式如下(切割两段）：
【主权项】
1. 一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 以Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护 氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂； 2) 用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将24肽从树脂上裂解下来并去除 侧链保护基团，得到抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品； 3) 将得到的抗病毒多肽PY-24及FY-24粗品采用高效液相色谱法，并选取合适的色谱 柱及流动相分离纯化，从而制备得到纯度大于98%的PY-24及FY-24精品。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)具体内容包括如下步骤： 1) 取Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入 脱冒试剂，反应10-30分钟，抽干，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤5-10次，抽干，以N，N-二甲基 甲酰胺为溶剂，加入Fmoc-Ala-OH，用0-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟磷酸盐/1-羟 基苯并三唑、〇-(苯并三唑-1-氧）-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑、 二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑中的一种混合物作为缩合剂，再加入N-甲基吗啉或二 异丙基乙胺中的一种作为有机碱调节反应溶液PH环境，反应0. 5-2小时，茚三酮法检测反 应终点，抽干，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-王树脂； 2) 在步骤（1)获得的Fmoc-Ala-Tyr(tbu)-王树脂中，加入脱帽试剂，反应10-30分钟， 抽干，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤5-10次，抽干，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入具有芴 甲氧羰基保护的氨基酸，用〇-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟磷酸盐/1-羟基苯并三 唑、〇-(苯并三唑-1-氧）-N，N，N，N-四甲基脲鑰六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑、二异丙基 碳二亚胺/1-羟基苯并三唑中的一种混合物作为缩合剂，再加入N-甲基吗啉或二异丙基乙 胺中的一种作为有机碱调节反应溶液PH环境，反应0. 5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽 干，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具 有芴甲氧羰基保护的氨基酸，如此反复，PY-24直至连完最后一个脯氨酸，FY-24直至连完 最后一个苯丙氨酸，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤3-5次，脱保护反应，N，N-二甲基甲酰胺洗 涤5-10次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到 侧链全保护的肽链树脂PY-24 和FY-24,PY-24 即Pro-His(trt)-Ser(tbu)-Gly-Ala-His(t rt) -Gly-Ile-Pro-Lys(boc) -Ile-Phe-Gly-Ala-Arg(pbf) -Ala-Gln(Trt) -Pro-Ala-Ala-Al a_Arg(pbf) -Ala-Tyr(tbu)-王树脂；FY-24 即Phe-Thr(tbu) -Ala-His(trt) -Leu-His(trt) -Thr(tbu)-His(trt)-His(trt)-Arg(pbf) -Ile-Gly-Gly-Ala-Arg(pbf) -Ala-Gln(Trt)-Pr O-Ala-Ala-Ala-Arg(pbf)-Ala-Tyr(tbu) -王树脂； PY-24所涉及具有荷甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf) -0H，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-〇H，Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(boc)-〇H，Fmoc-Pr〇-〇H，Fmoc-Ile-〇H，Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-His(trt)-〇H， Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ser(tbu) -〇H，Fmoc-His(trt) -〇H，Fmoc-Pro-OH; FY-24所涉及具有荷甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Arg(pbf) -0H，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-〇H，Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-His(trt)-OH,Fmoc-His(trt)-OH,Fmoc-Thr(tbu)-OH, Fmoc-His(trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-His (trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr (tbu)-OH， Fmoc-Phe-OH0
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr (tbu) -王树脂的取代度在 0. 2mmol/g-〇. 8mmol/g之间，Fmoc-Ala-OH量为Fmoc-Tyr (tbu)-王树脂摩尔量的 1-5 倍；脱 帽试剂为体积百分含量10-30%的哌啶/N，N-二甲基甲酰胺混合溶液，每一步保护氨基酸的 量的是Fmoc-Tyr (tbu) -王树脂摩尔量的1-5倍，缩合试剂的量是Fmoc-Tyr (tbu) -王树脂 摩尔量的1-5倍，有机碱的量是Fmoc-Tyr (tbu)-王树脂摩尔量的2-10倍，每一步反应终点 的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂的取代度 为0. 35mmol/g，Fmoc-Ala-OH量为Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的2倍；脱帽试剂为 体积百分含量20%的哌啶/N，N-二甲基甲酰胺混合溶液，每一步保护氨基酸的量的是 Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的2倍，缩合试剂为0-(苯并三唑-1-氧）-N，N，N，N-四甲基 脲鑰六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑，其用量是Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的2倍，有机 碱为N-甲基吗啉，其用量为Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂摩尔量的4倍。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括如下步骤：在侧链全保 护的肽链树脂中加入切割试剂，反应1-3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入 乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得PY-24及FY-24粗品。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述切割试剂的体积配比为三氟乙酸：三 异丙基硅烷：水=95%: 3%: 2%，反应2. 5小时。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)具体内容为：将PY-24和 FY-24多肽粗品溶于水中，制成200mg/ml的水溶液，用0. 45Mm滤膜过滤，用反相制备型 HPLC纯化收集所需组分，再用分析型HPLC分析检测所收集的组分，合并纯度在98%以上的 组分，合并液在35~40°C条件下减压浓缩，将浓缩液放入低温冷冻干燥机进行冷冻干燥，从 而得到PY-24及FY-24精品。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于反向制备型HPLC所采用的制备柱为C18类 型，流动相为水、醋酸铵水溶液、乙腈、甲醇中的一种或几种。
【专利摘要】本发明涉及一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽的制备方法，主要解决目前还没有工业化制备该化合物的方法。本发明采用固相合成方法及高效液相色谱纯化方法，主要包括以下几个步骤：1）以Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂；2）对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将24肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得到两条抗病毒多肽PY-24及FY-24的粗品；3）将得到的粗品采用高效液相色谱法纯化制备从而得到高纯度大于98%的多肽精品。本发明可低成本大规模化生产抗艾滋病毒组合多肽PY-24及FY-24。
【IPC分类】C07K1-06, C07K1-04, C07K1-16, C07K14-00
【公开号】CN104788546
【申请号】CN201510107894
【发明人】徐红岩, 竺剑峰
【申请人】吉尔生化（上海）有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月12日