一种基于多肽的玉米赤霉烯酮抗体模拟物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可作为玉米赤霉烯酮抗体模拟物的十二 肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEN)是由镰刀菌产生的一种类雌激素样真菌毒素， 其化学名为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基）0 -雷锁酸内酯，广泛存在于霉变的玉米、 高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶中。由于ZEN在谷物粮食中污染普遍，可通过食物 链的作用对家禽及人体健康产生毒害作用，因此对ZEN的监测就显得尤为重要。
[0003] 目前比较常用的检测ZEN的方法主要包括：高效液相色谱法（Highperformance liquidchromatography，HPLC)，气相色谱法（Gaschromatography，GC)，薄层层析法（Thin layerchromatography，TLC)，高效液相色谱-质谱联用法（Highperformanceliquid chromatography-masssepectrum，HPLC-MS)，微生物检测法和免疫检测法等，其中免疫学 分析方法以其灵敏度高、操作简单以及可实现规模化筛选等优点，在ZEN的快速检测领域 中得到了广泛的应用。
[0004] 免疫学分析方法的核心在于抗原-抗体间的特异性识别及结合，因此制备特异性 结合抗原的抗体就成为发展免疫学分析方法的前提与核心。抗体的研宄近年来发展迅猛， 已经从传统的多克隆、单克隆抗体，发展至以单链抗体、噬菌体展示抗体、单域重链抗体、抗 独特型抗体等为代表的基因工程抗体领域。新型抗体具有分子量小、结构简单、可自我进 化、制备快捷的特点及发展趋势。例如，单克隆抗体、单链抗体、单域重链抗体的分子量逐渐 减少，分别为150、30-50、15-20kDa，以Lipocalin为骨架蛋白的抗体类似物为18-20kDa，而 核酸适配体则仅为一小段核酸序列。
[0005] 随着噬菌体展示多肽库技术的迅速发展，通过噬菌体展示肽库的淘选，可快速、简 单地获得与特定靶体分子特异性结合的多肽分子，因此，多肽分子可成为传统抗体的替代 物并应用于免疫学分析体系。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶 体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高 亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用 广泛，但是上述噬菌体展示多肽技术的应用大多局限于以大分子蛋白质为靶体分子进行亲 和淘选。由于蛋白质表面具有多个拷贝的表位，因此非常容易获得与之对应结合的多肽分 子。目前的多肽分子大多作为抗原的模拟表位（抗原替代物）应用于免疫学分析中，而将 多肽分子作为小分子物质抗体的替代物应用于免疫学分析的报道较少，其原因在于，小分 子物质体积过小，且表面没有丰富的氨基、羧基基团，难以与多肽分子结合，从而造成淘选 困难。
[0006] 本发明通过噬菌体展示多肽库技术，采用磁珠液相亲和淘选并结合ZEN抗体竞争 性洗脱的方式，通过优化孵育、洗脱时间，温度等条件，从噬菌体展示多肽库中快速筛选到 能与ZEN特异性结合的多肽分子，该多肽分子具有与传统的ZEN单克隆抗体分子相似的免 疫学检测特性，可作为传统ZEN抗体的替代物应用于ZEN的免疫学分析体系。该方法避免了 制备传统的单克隆抗体分子所需要经过周期长的免疫过程、细胞融合、单克隆筛选等流程， 具有无需免疫过程、筛选方便、周期短、制备成本低等特点。
【发明内容】
[0007] 本发明以ZEN全抗原（ZEN与牛血清白蛋白的偶联物ZEN-BSA)为靶分子，将靶分 子结合到磁珠上，投入噬菌体随机展示十二肽库，进行磁珠液相亲和淘选，结合ZEN抗体竞 争性洗脱的方式，优化淘选、洗脱时间及温度等条件，获得了一种可特异性结合ZEN的多肽 分子，其氨基酸序列为：SSILMKLRPLKH。
[0008] 上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其 D-型异构体的一种，即S代表丝氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，L代表亮氨酸残基，M代表 甲硫氨酸残基，K代表赖氨酸残基，R代表精氨酸残基，P代表脯氨酸残基，H代表组氨酸残 基。
[0009] 本发明还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列的核苷酸，其序列为：
[0010] TCTTCTATTCTTATGAAGCTTAGGCCTCTTAAGCAT
[0011] 本发明提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进 行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖 生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通 过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基 因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。
[0012] 本发明还涉及所述多肽分子在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括 酶联免疫吸附检测等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明所提及的多肽分子可替代传统的ZEN抗体分子，作 为ZEN的结合分子直接应用于免疫学检测分析，基于多肽分子的间接竞争ELISA标准曲线 其线性范围宽广，该多肽分子具有无需免疫过程、获取方便、快速、周期短等特点。
【附图说明】
[0014] 图1基于多肽的ZEN抗体模拟物的间接竞争ELISA标准曲线。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1.基于多肽的ZEN抗体模拟物的磁珠液相亲和淘选及其鉴定
[0016] 1)亲和淘选与ZEN特异性结合多肽分子的具体方法为：为高效获得可与ZEN分子 特异性结合的多肽分子，采用了磁珠液相亲和淘选并结合ZEN抗体竞争性洗脱的方式，具 体方法为：取I.Omg羧基化的磁珠分子（直径1500nm)，用PBST洗涤3次。加入10yL噬菌 体随机展示十二多肽库（2X10npfu，NEB公司），后加入900yLPBST，与磁珠混合，室温下 轻摇震荡反30min，磁分离后（此步骤的目的在于去除噬菌体展示肽库中与磁珠表面修饰 基团结合的多肽分子，这类多肽分子吸附在磁珠表面并通过磁分离而去除掉），小心吸取上 清液（不与磁珠表面修饰基团结合的多肽分子）至另一新离心管，加入I.OmgZEN-BSA偶联 的磁珠（直径1500nm，ZEN-BSA的偶联量为I.Omg，ZEN=BSA的偶联比为10:1，偶联物的制备 方法参见Burkineaal.，2000,Appliedbiochemistryandmicrobiology, 36, 282-288))， 室温下震荡反应30min。磁分离后，用TBST洗涤6次，洗去未结合的噬菌体。加入ImL50ng/ mLZEN抗体（PBS体系），室温下轻摇震荡30min。磁分离后，小心吸取上清，获得第一轮 亲和淘选产物，留10UL测滴度，将剩余噬菌体投入处于对数前期的ER2738进行扩增，然 后依次进行第2轮和第3轮淘选，淘选步骤与第一轮大体相同，每次加入的噬菌体量均为 2X10npfu，不同之处在于：第2、3轮筛选的噬菌体展示多肽与ZEN-BSA偶联磁珠的孵育时 间分别为20min、10min，竞争洗脱液（ZEN抗体）的浓度分别为25ng/mL，15ng/mL。
[0017] 2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑 取80个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体 克隆的鉴定，具体方法为：首先，用IOmMPBS(pH7.