大白菜est-ssr标记及其引物与应用
【技术领域】
[0001] 本发明专利设及大白菜EST-SSR标记及其引物与应用，特别设及S组大白菜 EST-SSR标记及其引物和在品种指纹图谱构建中的应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 分子标记的出现使得育种工作中的选择由传统的表型选择转变为基因型选择， 大大提高了选择的准确性和效率，因此分子标记自一出现即成为育种工作及遗传学研究 重要的不可缺少的工具。特别是基于PCR的分子标记如RAPD(Williamsetal. ,1990)、 SSR(A化ayaetal.，1992)、AFLP(Vosetal. ,1995)等的出现，因其简便、快速和高效等特 点，使分子标记的开发与利用已遍及各种作物。SR(Simplesequencerepeat),又称微卫星 DM,是由1-6个核巧酸组成的基序串联重复序列。同一物种的不同材料SSR基序重复次数 不同，用重复区两侧相对保守的单拷贝序列设计引物，对基因组总DNA进行扩增，扩增片断 的长度多态性可作为不同材料的特异分子标记。SSR标记具有多态性高、共显性、可靠性高、 技术难度低等优点，已被广泛应用于各种作物遗传图谱的构建、分子标记辅助选择、功能基 因定位W及各种作物种质资源遗传多样性的评价等研究中（PlieskeandStruss，2001 ;方 宣钓等，2001)。
[0003] 近年来植物结构基因组学和功能基因组学迅猛发展，人们获得了许多植物大量的 基因组序列、EST序列W及全基因序列。该种时代背景下，在评价种质资源多样性时，人们 更希望能了解资源材料中功能基因的多样性（Varshneyetal.，2005a)。该就促使人们 从功能基因序列中寻找可遗传变异。经过分析，人们在EST序列中（包括基因的编码区、 5' -UTR区及3' -UTR区）发现了大量的可变异的SSR位点，即EST-SSR。此外，人们在功能基 因区还开发了SNP(SingleNucleotidePolymo;rphism)、COS(Conse;rvedOrthologousSets ofmarkers)等标记技术，该些标记均可用来对功能基因的多样性进行评价（Varshneyet al.，2005a)。但由于具有多态性高、可靠性高、技术难度低、共显性等优点，EST-SSR成为 目前植物功能基因多样性研究的主要工具。现已在小麦、水稻、玉米、棉花等许多作物中开 发出大量的EST-SSR引物，用于该些作物的遗传多样性评价W及其它工作中（Varshneyet al. , 2005b)。
[0004] 大白菜炬rassicarapassp.pekinensis，AA基因组，2n= 20)为十字花科芸臺 属植物，原产于我国，现广泛栽培于我国、韩国、朝鲜及日本。因其营养丰富且富含膳食纤 维，人们普遍喜欢食用，在我国W及世界许多国家的蔬菜生产和消费中占有非常重要的地 位。目前根据大白菜基因组测序结果W及数据库中的EST序列，已经开发了大量EST-SSR 标记（LiandZheng, 2009;Lietal. , 2009b;Xinetal. , 2006;Paidaetal. 2010;Geet al.，2011;Ramchiaryetal.，2011;Shietal. 2014)。但是有关大白菜EST-SSR引物的开 发仍未达到饱和。开发新的EST-SSR引物，对于构建高密度遗传图谱和品种指纹图谱具有 重要意义，对于大白菜的分子育种工作将有现实的指导W及实践意义。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供大白菜EST-SSR标记及其引物与应用。本发明 提供了 3组EST-SSR标记BR-eslO、BR-esl3和BR-esl5的引物，并将它们应用于品种指纹 图谱的构建中。
[0006] 本发明技术方案如下；
[0007] 大白菜EST-SSR标记BR-eslO,核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 大白菜EST-SSR标记BR-eslO的引物，该检测引物为一对，上游引物核巧酸序列如 SEQIDNO. 2所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0009] 大白菜EST-SSR标记BR-esl3,核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0010] 大白菜EST-SSR标记BR-esl3的引物，该检测引物为一对，上游引物核巧酸序列如 SEQIDNO. 5所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0011] 大白菜EST-SSR标记BR-esl5,核巧酸序列如SEQIDNO. 7所示。
[0012] 大白菜EST-SSR标记BR-esl5的引物，该检测引物为一对，上游引物核巧酸序列如 SEQIDNO. 8所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 9所示。
[0013] 上述大白菜EST-SSR标记BR-eslO的引物、大白菜EST-SSR标记BR-esl3的引物 和/或大白菜EST-SSR标记BR-esl5的引物在大白菜品种鉴定及品种指纹图谱构建中的应 用。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明首次公开了大白菜EST-SSR标记BR-eslO及其引物、大白菜EST-SSR标记 BR-es13及其引物和大白菜EST-SSR标记BR-es15及其引物，通过对24个大白菜品种的DNA 进行扩增，并利用6 %变性聚丙締酷氨凝胶和/或12 %非变性聚丙締酷氨凝胶电进行检测， 发现上述3组EST-SSR引物的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，能够很好 的区分不同的品种，可用于大白菜品种的鉴定及品种指纹图谱的构建。
【附图说明】
[0016] 图1是大白菜EST-SSR标记BR-eslO的引物在24个大白菜材料中的PCR扩增电 泳图；
[0017] 图2是大白菜EST-SSR标记BR-esl3的引物在24个大白菜材料中的PCR扩增电 泳图；
[001引图3是大白菜EST-SSR标记BR-esl5的引物在24个大白菜材料中的PCR扩增电 泳图；
[001引图中；泳道1、682 ;泳道2、广东早；泳道3、早皇白；泳道4、Z61-8 ;泳道5、福山包 头；泳道6、Li-3 ;泳道7、212-7 ;泳道8、天津青麻叶；泳道9、快菜6号；泳道10、黄金小白 菜J ;泳道11、四季小白菜；泳道12、四季黄秩小白菜；泳道13、品早1号；泳道14、韩育特 选黄屯、；泳道15、全能四季快菜；泳道16、京优小白菜快菜；泳道17、高丽金娃娃；泳道18、 可义夏娃娃；泳道19、金诺春秋娃娃菜；泳道20、四季绿杆小苦菜；泳道21、油绿157 ;泳道 22、束腰油菜；泳道23、德高油亮青梗菜；泳道24、青秀F1青梗菜。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保 护范围不限于此。
[0021] 生物材料来源
[002引 682、广东早、早皇白、Z61-8、福山包头、Li-3、212-7、快菜6号、品早1号均购自山 东登海种业股份有限公司西由种子分公司；
[0023] 天津青麻叶购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
[0024] 黄金小白菜购自安徽仁信种子有限公司；
[0025] 四季小白菜购自天津英良种业；
[0026] 四季黄秩小白菜购自江西省丰城市航城种业有限公司；
[0027] 韩育特选黄屯、购自青县纯丰蔬菜良种繁育场；
[002引全能四季快菜购自青岛市黄岛区黄海泽农种苗研究所；
[0029] 京优小白菜快菜购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
[0030] 高丽金娃娃购自北京市特种蔬菜种苗公司；
[0031] 可义夏娃娃购自北京卓生农业科技有限公司；
[0032] 金诺春秋娃娃菜购自北京金诺阳光种子有限责任公司；
[0033]四季绿杆小苦菜购自云鸿蔬菜花弁种苗研究所；
[0034] 油绿157购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
[0035] 束腰油菜购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
[0036] 德高油亮青梗菜购自山东德州市德高蔬菜种苗研究所德州市蔬菜工程技术研究 中屯、；
[0037] 青秀F1青梗菜购自青岛国际种苗有限公司。
[0038] 实施例1. EST-SSR引物的开发
[0039] 开发EST-SSR引物所用的EST序列来自于本课题组对大白菜炬.rapaSSP. pekinensis)莲座叶和球叶的高通量转录组测序（Wangetal. ,2012)。通过转录组测 序，共获得5, 347万条高质量EST序列。对该些EST序列利用Trinity软件(http:// trinitvrnase日sourceforge.net/)进行组装，得到相应的contig和unigene,然后利用 TGI化软件包（TIGRGeneIndicesClustering)去冗余，共获得5. 2万个Unigene。本研究 利用MISA软件化ttp://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)对该 5. 2 万个Unigene进 行了EST-SSR的分析和鉴定（标准参见aiangetal. ,2004)，共获得1. 04万个EST-SSR。 通过与大白菜SSR数据库(http://oilcroDs.inf(VSSRdb)中已知的SSR进行比对，共发现 2701个新的EST-SSR。选取其中的3对引物用于品种鉴定分析（见表1)。
[0040] 表1.本研究开发的3对EST-SSR引物
[0041]
【主权项】
1. 大白菜EST-SSR标记BR-eslO,核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
2. 大白菜EST-SSR标记BR-eslO的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如 SEQIDNO. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
3. 大白菜EST-SSR标记BR-esl3,核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示。
4. 大白菜EST-SSR标记BR-esl3的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如 SEQIDNO. 5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
5. 大白菜EST-SSR标记BR-esl5,核苷酸序列如SEQIDNO. 7所示。
6. 大白菜EST-SSR标记BR-esl5的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如 SEQIDNO. 8所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO. 9所示。
7. 权利要求2所述大白菜EST-SSR标记BR-eslO的引物、权利要求4所述大白菜 EST-SSR标记BR-es13的引物和/或权利要求6所述大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物 在大白菜品种鉴定及品种指纹图谱构建中的应用。
【专利摘要】本发明涉及大白菜EST-SSR标记及其引物与应用。本发明公开了大白菜EST-SSR标记BR-es10及其引物、大白菜EST-SSR标记BR-es13及其引物和大白菜EST-SSR标记BR-es15及其引物，通过对24个大白菜品种的DNA进行扩增，并利用6％变性聚丙烯酰氨凝胶和/或12％非变性聚丙烯酰氨凝胶电进行检测，发现上述3组EST-SSR引物的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，能够很好的区分不同的品种，可用于大白菜品种的鉴定及品种指纹图谱的构建。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104774951
【申请号】CN201510192389
【发明人】李景娟, 高建伟, 王凤德, 李化银, 张一卉, 丁谦
【申请人】山东省农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月22日