一种检测肝素粗品基因的荧光定量pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中的一种检测肝素粗品基因的方法，具体设及一种检测 肝素粗品基因的巧光定量PCR方法。
【背景技术】
[0002] 肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血 作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、屯、肌梗死、屯、血管手术、屯、脏导管检查、体外循环、 血液透析等。随着药理学及临床医学的进展，肝素的应用不断扩大。肝素首先从肝脏发现 而得名，它也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。天然存 在于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。我国是肝素产量最大的国家，国际市场 的肝素70%来自于中国。通常先从猪小肠粘膜中提取肝素粗品，然后纯化，再生产肝素原料 药。因而，肝素粗品作为下游原料，对肝素粗品基因的检测很重要，直接影响肝素一大类药 的质量。
[0003] 目前对于基因的检测主要通过常规PCR的方法，而常规PCR技术是对PCR扩增反 应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 巧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入巧光基团，利用巧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。巧光定量PCR技术是利用巧光 信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析。
[0004] 巧光定量PCR作为一种高灵敏、高速度、高通量及特异性强的检测技术，在生物分 析领域也具有广阔的应用前景。该方法已用于基因扩增、扩增特异性分析、基因定量分析、 基因检测、基因分型、SNP分析、RFLP多态性分析、单/多基因表达研究、高通量基因表达谱 研究。
[0005] 因此，我们设计了种巧光定量PCR的方法来检测肝素粗品中的基因。包括肝素粗 品中总DNA的提取，巧光PCR扩增反应，数据分析。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测肝素粗品基因的巧光定量PCR方法。本发明的目的 是通过W下技术方案来实现：
[0007] 一种检测肝素粗品基因的巧光定量PCR方法，所述方法包括肝素粗品中总DNA的 提取、设计引物和探针、巧光PCR扩增反应W及数据分析，所述引物为上游引物和下游引 物，所述探针为巧光探针。
[000引进一步地，肝素粗品中总DNA的提取包括；①配制肝素粗品溶液；称取肝素粗品30mg溶于1ml纯化水，再用肝素酶作用缓冲液将上述溶液稀释100倍，得到肝素粗品溶液； ②核酸酶的灭活；将肝素粗品溶液在恒温仪上85°C恒温5min，然后冰浴lOmin，并通过核酸 定量仪测定其中的DNA浓度，记为C总；⑨肝素酶降解：在200 y 1经核酸酶灭活过的肝素 粗品溶液中加入约0.Oliu的肝素酶，在恒温混匀仪上震荡混匀，25°C恒温1她，离屯、取上清 液，4°C保存待用，作为酶解后的供试品溶液。
[0009] 进一步地，所述巧光PCR扩增反应包括配制PCR体系W及PCR体系扩增反应。
[0010] 进一步地，所述配制PCR体系包括DNA标准品溶液、酶解后的供试品溶液、阴性对 照溶液、上游引物溶液、下游引物溶液、探针溶液、Mastermix(PCR试剂预混液）化及水；所 述阴性对照溶液为纯水。
[0011] 进一步地，所述巧光探针为在探针中加入了巧光基团得到巧光探针。
[0012] 进一步地，所述PCR体系扩增反应为；①在95°C下预变性lOmin;②在95°C下变性 15s;⑨在63°C下退火20s;④在72°C下延伸40s(巧光采集）；热循环次数为40次。
[0013] 进一步地，所述数据分析包括标准曲线的绘制、系统适用性判断W及供试品各基 因相对含量的计算。
[0014] 进一步地，所述标准曲线的绘制为由各浓度DNA标准品溶液与其对应的扩增曲线 Ct(threshold巧cle)值，得出标准曲线。
[0015] 进一步地，所述的数据分析中系统适用性判断为；绘制标准曲线，标准曲线的确定 系数（R2) >0.98,斜率> -4.0,阴性对照的Ct(t虹esholdcycle)值应大于标准曲线最低 浓度样品的Ct值，或没有扩增。
[0016] 进一步地，所述的数据分析中供试品各基因相对含量的计算为；系统适用 性符合要求后，由标准曲线得出供试品中各基因浓度根据公式计算各种属基因含 量：
【主权项】
1. 一种检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述方法包括肝素粗品 中总DNA的提取、设计引物和探针、荧光PCR扩增反应以及数据分析，所述引物为上游引物 和下游引物，所述探针为荧光探针。
2. 根据权利要求1所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：肝素 粗品中总DNA的提取包括： ① 配制肝素粗品溶液：称取肝素粗品溶于纯化水中，再用肝素酶作用缓冲液将上述溶 液稀释后得到肝素粗品溶液； ② 核酸酶的灭活：将肝素粗品溶液在85°C下恒温5min，然后冰浴lOmin，并通过核酸定 量仪测定其中的DNA浓度，记为C总； ③ 肝素酶降解：在经核酸酶灭活过的肝素粗品溶液中加入肝素酶，在恒温条件下震荡 混匀，25°C恒温18h，离心取上清液，作为酶解后的供试品溶液，4°C保存待用。
3. 根据权利要求1所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述 荧光PCR扩增反应包括配制PCR体系以及PCR体系扩增反应。
4. 根据权利要求3所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述 配制PCR体系包括DNA标准品溶液/酶解后的供试品溶液/阴性对照溶液、上游引物溶液、 下游引物溶液、荧光探针溶液、Mastermix以及水；所述阴性对照溶液为纯水。
5. 根据权利要求1或4所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于： 所述荧光探针为在探针中加入了荧光基团得到荧光探针。
6. 根据权利要求3所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述 PCR体系扩增反应为：①在95°C下预变性lOmin;②在95°C下变性15s;③在63°C下退火 20s;④在72°C下延伸40s进行荧光采集；热循环次数为40次。
7. 根据权利要求1所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述 数据分析包括标准曲线的绘制、系统适用性判断以及供试品各基因相对含量的计算。
8. 根据权利要求7所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述 标准曲线的绘制为由各浓度DNA标准品溶液与其对应的扩增曲线Ct值，得出标准曲线。
9. 根据权利要求7所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所 述的数据分析中系统适用性判断为：绘制标准曲线，标准曲线的确定系数多0.98,斜率 多-4. 0,阴性对照的Ct值大于标准曲线最低浓度样品的Ct值，或没有扩增。
10. 根据权利要求7所述的检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，其特征在于：所述 的数据分析中供试品各基因相对含量的计算为：系统适用性符合要求后，由标准曲线得出 供试品中各基因浓度C#根据公式计算各种属基因含量：
【专利摘要】本发明涉及一种检测肝素粗品基因的荧光定量PCR方法，包括肝素粗品中总DNA的提取、荧光PCR扩增反应以及数据分析。本发明简洁明了，易操作，准确性高，所采用的荧光定量PCR检测方法，巧妙的运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏的检测肝素粗品中的基因。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104774947
【申请号】CN201510179643
【发明人】周翔, 王轲, 陶翎, 顾春华
【申请人】常州千红生化制药股份有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月15日