微拟球藻同质型乙酰辅酶羧化酶1的编码基因及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从微拟球藻中克隆参与脂肪酸合成代谢 的关键酶乙酰辅酶A羧化酶1 (NgACCl)基因及其应用。 二、
【背景技术】：
[0002] 乙酰辅酶羧化酶是一类以生物素为辅基，以HCCV为羧基供体的羧化酶，在ATP供 能、Mg2+存在下，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰单酰辅酶A。丙二酸单酰辅酶A即是从头 合成脂肪酸途径中的C2单位的供体，又在脂肪酸的氧化中作为线粒体穿梭系统的调节因 子。ACC主要分为异质型和同质型两大类，异质型ACC又称多亚基型，存在于细菌、双子叶 植物和非禾本科单子叶植物中（CronanJEJr，WaldropGL.Multi-subunitacetyl-CoA carboxylases.ProgLipidRes，2002,41(5) :407_435)，由 4 个亚基组成，即生物素竣化酶 (Biotincarboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白（Biotincarboxylcarrierprotein， BCCP)以及生物素羧基载体蛋白（Carboxyltransferase，CT)的2个亚基a-CT和P-CT 异质型：同质型即多功能型，其BC、BCCP、CT功能域依次存在于一条多肽链上。动物、酵母、 藻类及高等植物中含有此类（Choi-RheeE，CronanJE.Thebiotincarboxylase-biotin carboxylcarrierproteincomplexofEscherichiacoliacetyl-CoAcarboxylase. JournalofBiologicalChemistry. 2003,278(33) :30806-30812)。此外，同质型ACC又可 分为两个亚型：ACC1和ACC2,其中ACC1催化合成的丙二酰单酰辅酶A用于胞质溶胶中脂肪 酸的合成。
[0003] 在大多数植物中，ACC属于多亚基型，其四个亚基a-CT、BCCP、BC和0 -CT分别 由accA、B、C和D基因编码，除accD基因存在于叶绿体体中外，其他编码基因位于细胞核 中。各个亚基在催化作用中具有不同的功能，BCCP蛋白是连接ACC另外3个亚基的纽带和 桥梁，在植物种子脂肪酸的合成过程中起着十分重要的作用。研究表明在拟南芥、油菜以 及蓖麻的种子发育过程中过量表达BCCP基因，可以提高ACC的活性以及种子中油脂含量 (RoeslerRK,SavageLJ,ShintaniDK,etal.Co-purification,co-immunoprecipitation, andcoordinateexpressionofacetyl-coenzymeAcarboxylaseactivity.biotin carboxylase,andbiotincarboxylcarrierproteinofhigherplants.Planta 1996,198 :517_525;BenningF,ffinkledlC.AnovelmutantofArabidopsiswitha deficiencyintheseed-specificregulationofcarbohydratemetabolism[J]?Plant Physiology, 1998. 118 :91-101)。P-CT亚基是ACCase活性的限制因子，质体中超量表达 accD基因会提高ACCase的酶活水平，从而提高脂肪酸的合成。该基因在烟草和马铃薯中 得到了研究。此外，非禾本科植物质体中的ACC为异质型，相反禾本科植物质体中ACC为 同质型，针对这一点可以设计杂草敏感而对其它作物无影响的特异性除草剂（TurnerJA, PernichDJ.Originofenantiomericselectivityinthearyloxyphenoxypropionic acidclassofherbicidalacetylcoenzymeAcarboxylase(ACCase)inhibitors AgricultureFoodChemistry，2002, 50(16) :4554_4566)。动物中的ACC属于多功能型， 人类的ACC的两个亚型已成功进行了克隆表达，研究表明，ACC的表达可能与前列腺癌 的发生有关;ACC2活性的降低或缺失，有可能抵抗摄食过多引起的肥胖，可作为防治肥胖 症的新革巴点（EssopMF，CampHS，ChoiCS，etal.Reducedheartsizeandincreased myocardialfuelsubstrateoxidationinACC2mutantmice.AmericanJournalof Physiology:HeartandCirculatoryPhysiology，2008,295(l) :H256_65) ?微藻的ACC 属于同质型，目前仅在娃藻和蓝藻究中进行了研究（RoesslerPG，OhlroggeJB.Cloning andcharacterizationofthegenethatencodesacetyl-coenzymeAcarboxylase inthealgacyclotellacryptica.JournalBiologyChemistry，1993,268 (26)： 19254-19259 ;宋东辉，侯李君，施定基生物柴油原料资源高油脂微藻的开发利用，2008， 24(3) :341-348)。
[0004] 由于世界能源危机和环境问题的日益严重，开发绿色、清洁的生物燃料代替传统 石化燃料，已成为国际研究热点。在生物燃料的众多原料中，微藻具有光合作用效率高、含 油量高、生长周期短、油脂面积产率高等特点，被认为是最有潜力替代石油的生物质资源。 如何进一步提高微藻的产量和油脂含量以成为人们关注的问题。微藻生长条件的优化和光 生物反应器的推广使微藻产量上了一个新台阶，脂肪酸代谢机理的研究为进一步提高油脂 含量提供改造方法。参与脂肪酸代谢的关键酶对脂肪酸的积累起着不可替代的作用。我们 对参与脂肪酸从头合成代谢途径的第一步反应的作用酶也是关键酶的ACC1进行了研究。 从前期实验室构建的微拟球藻（Nannochloropsisgaditana)转录组文库筛选出了与脂肪 酸合成密切相关的ACC1基因，克隆表达并对其环境胁迫下基因表达变化等进行了研究。填 补了ACC在微藻中研究的空缺，并对利用基因工程改造获取高油脂产量微藻及油料作物的 研究奠定了良好的基础。 三、
【发明内容】
：
[0005] 本发明的一个目的是提供一种来自微拟球藻脂肪酸合成代谢密切相关的同质型 蛋白酶基因NgACCl，补充现有同质型ACC研究的不足，同时为构建高产油微藻藻株提供基 因资源；本发明的又一目的是构建真核表达载体pAUR123-NgACCl，在转基因酵母中获得高 效表达，完善了同质型ACC1的真核表达系统；本发明的再一目的是提供逆境条件下的研究 对象，为研究不同胁迫环境中该基因的表达以及对油脂积累的潜在影响提供基础。
[0006] 本发明是通过以下方案实现的：
[0007] 本发明所述的从微拟球藻中克隆NgACCl基因，其核苷酸序列为SEQID:1 ;氨基酸 序列为SEQID:2。
[0008] 本发明从微拟球藻中克隆NgACCl基因的过程如下：
[0009] 根据本实验室前期构建的微拟球藻转录组数据库中基因注释及NCBI比对结果获 得编码NgACCl基因序列信息，设计8对引物（其序列为SEQID:3-10)，采用重叠延伸PCR 技术分段扩增后，经连续拼接获得大小为7101bp的目的片段。
[0010] 上述基因真核表达载体pAUR123-NgACCl的构建通过以下过程实现：
[0011] 将上述获得的PCR产物纯化后用Smal和Hpal限制性酶进行双酶切，表达载体 PAUR123也进行同样的处理。胶回收目的片段和表达载体大片段，利用T4连接酶进行连接 后转化大肠杆菌后，经PCR、酶切和测序鉴定后获得重组pAUR123-NgACCl。