一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于苯丙氨酸制备技术领域，具体涉及一种酶催化不对称还原制备手性苯 丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 手性氨基酸（天然L-氨基酸和非天然D~氨基酸）是合成手性药物、手性农药和 手性食品添加剂等精细化工品的关键中间体。许多新药（如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药 等）的制备需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而众多手性氨基酸的合成离不开氧化 还原酶的催化，因此寻找高选择性的氧化还原酶成为手性氨基酸研宄的热点。
[0003] 苯丙氨酸主要用作试剂及医药上的胃肠外营养输液，亦见用作特殊人员合成膳 食、必需氨基酸片等营养强化剂的成分。L~苯丙氨酸是合成一些抗癌药物的中间体和良 好载体，通过L~苯丙氨酸可以把抗肿瘤药物载入肿瘤所在的部位，不但可以抑制肿瘤生 长，而且又可降低肿瘤药物的毒性。随着甜味剂二肽阿斯巴甜（APM)投放市场，L~苯丙氨 酸作为它的主要原料，需求量急剧增加。D~苯丙氨酸营养价值虽小，但具有出色的镇疼作 用。临床实验已表明，对一批长期用各种疗法无效的肌肉疼、关节疼、腰腿疼患者疗效显著， 并且无明显副作用。
[0004] 苯丙氨酸在人体内不能合成，必须由外界供给，因此研宄其合成方法很有必要。苯 丙氨酸的制备方法通常有两种，即化学合成法和微生物发酵法。化学合成法的收率较低；需 使用剧毒的氰化物，污染环境；副反应较多；工艺路线长等缺点。而微生物发酵法具有环境 友好，节能绿色等优点，缺点是发酵产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种酶催化不对称还原制备手性苯丙 氨酸的方法。本发明利用全细胞中苯丙氨酸脱氢酶的高度对映体选择性，催化苯丙酮酸的 不对称还原胺化，获得L~苯丙氨酸，葡萄糖等辅助底物加入用于辅酶NADH的循环再生。其 以葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下：
[0006]
[0007] 本发明的具体技术方案如下：
【主权项】
1. 一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)将菌种接入2216L培养基中培养后，提取基因组DNA;所述菌种为嗜碱芽孢杆菌 (Bacillus halodurans)MCCC 1B00241 ; (2) 以步骤（1)所得基因组DNA为模板扩增如SEQID01所示的苯丙氨酸脱氢酶基因 序列，并装载到pET28a载体上，转入大肠杆菌中即得到工程菌； (3) 将步骤（2)所得工程菌接入含卡那霉素的LB液体培养基中培养，培养结束获得的 发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配置成细胞液； (4) 在步骤（3)所得细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于 辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化反应得到产物手性苯丙氨酸，上述反应条 件为：pH7~13,反应温度20°C~50°C下，震荡速率100~300rpm，反应时间24~168h; 体系中NADH的量为浓度1~I. 5mM的溶液0. 05~0. 07mL，所述苯丙酮酸在反应体系中的 的终浓度为〇? 02~0? 5mol/L，所述氨基供体为终浓度0? 05~lmol/L的氨水、NH4CKNH4NO3 或甲酸铵，所述辅助底物为终浓度〇. 001~lmol/L的葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖何异丙醇 中的至少一种，所述缓冲液为0. 01~0. 2mol/L的pH为7~13的NH4Cl-氨水，Tris~盐 酸、乙酸钠溶液、碳酸钠溶液或磷酸钾溶液。
2. 如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在 于：所属步骤（1)的培养的条件为：起始PH6. 5~8. 0,装液量体积分数为5%~15%，培 养温度20~40°C，摇床转速150~250rpm，培养时间12~48h。
3. 如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在 于：所述步骤⑵的扩增所用引物为Bs-F和Bs-R，引物序列分别如SEQID02和SEQID 03所示。
4. 如权利要求3所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征 在于：所述扩增具体为：反应体系：22yLH20，lyLBs-F，lyLBs-R，lyL总DNA，25yL PrimeSTARMaxPremix;反应条件：94°C预变性 5min，94°C变性 10s，56°C复性 10s，72°C延 伸6s，循环30次，72°C延伸lOmin。
5. 如权利要求I所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在 于：所述步骤（3)中卡那霉素的接种前终浓度为50~150ug/mL，所述培养的条件为：37°C， 150~250rpm培养1. 5~3h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5~15mg/ml，继续在25~ 30°C，150 ~250rpm下培养 5 ~6h。
6. 如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在 于：所述步骤（4)的细胞液的浓度为0. 025~130g/L。
7. 如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在 于：所述氨基供体为终浓度〇? 1~lmol/L的氨水或NH4Cl。
8. 如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在 于：所述辅助底物为终浓度〇. 05~lmol/L的葡萄糖和/或甘油。
9. 如权利要求1所述的一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在 于：所述缓冲液为〇? 01~〇? 2mol/L的pH为8的NH4Cl-氨水。
【专利摘要】本发明公开了一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：(1)基因组DNA的提取；(2)基因克隆及工程菌的制备；(3)细胞液制备：(4)全细胞催化反应：在步骤3)的细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性苯丙氨酸。本发明的方法采用全细胞催化苯丙酮酸不对称还原胺化获得手性苯丙氨酸，具有反应路线简洁，易实现辅酶再生等优点。
【IPC分类】C12R1-07, C12P13-22
【公开号】CN104726514
【申请号】CN201510165635
【发明人】方柏山, 江伟, 王世珍
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月9日